细胞工程复习材料

细胞工程复习材料细胞工程复习材料 细胞工程复习材料细胞工程基础1 细胞工程指应用细胞生物学 发 育生物学 遗传学和分子生物学的理论与方法 通过类似于工程学 的步骤 在细胞整体水平或细胞器水平上 按照人们的意愿来对细 胞的遗传表型进行定向改造 以获得新型生物或一定细胞产品的一 门综合性科学技术 细胞工程的核心技术细胞培养与繁殖目的获得新性状 新个体 新 物质2细胞工程实验室的组成无菌操作室 培养室 温室 细胞学 鉴定室 制备室 储藏室和清洗灭菌室 细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要 即实验准备 包括培 养基配制 洗涤与灭菌等 无菌操作 控制培养 常用灭菌与消毒技术 1 物理方法干热 湿热 过滤 0 25微米 紫外灯 超声波等 湿热灭菌适用于各种器皿 培养基 器皿 蒸馏水 棉塞 纸等 121 维持20 30min注意点加足水 排尽气 气压降到0时 才能开 盖过滤灭菌培养基的灭菌一般用高压高温处理 但如果培养基中某 些成分遇到高温分解 如某些生长调节剂GA 3 玉米素等 就需要过滤灭菌 另外酶 血清等也需要过滤灭菌干热灭菌适用于玻璃器皿和金属器 械的灭菌 操作方法利用烘箱加热到160 180 40min或120 120min 如果 发现芽孢杆菌 160 90 120min 3射线灭菌主要是利用紫外灯进 行照射 适合实验室空气 操作台等 灭菌时间20 30min 注意关灯后5min后再进入 超净工作台关灯后要打开风机 火焰灼烧灭菌用火焰灼烧达到灭菌目的 适用于接种器皿的灭菌 2 化学方法使用灭菌剂或抗菌素 如酒精 次氯酸钠 升汞 漂白 粉 高锰酸钾 双氧水 福尔马林等 能使微生物的蛋白质变性 或竞争其酶系统 或除低其表面张力 增加菌体细胞质膜的通透性 使细胞破裂或溶解 从而达到杀菌的 作用 适用外植体 实验器皿 操作表面 皮肤及无菌操作室等 熏蒸消毒利用加热焚烧 氧化反应等方法 使化学药剂变为气体状 态扩散到空气中 以杀死空气中和物体表面的微生物 常用甲醛 高锰酸钾熏蒸药剂喷雾消毒物体表面重用一些药剂涂擦 或者喷雾灭菌 4 培养基 Medium 是供微生物 植物和动物组织生长和维持用的 人工配制的养料 一般都含有碳水化合物 含氮物质 无机盐 包 括微量元素 以及维生素和水等 有的培养基还含有抗菌素和色素植物细胞培养基的组成及其配制无 机营养物质大量元素N P K Ca Mg S微量元素Fe Cu Zn B Mo M n Co Cl有机化合物维生素类硫胺素 VB1 与愈伤组织的产生和 生活力有关 可能是所有植物组织培养初期需要的维生素 而盐酸 吡哆醇 VB6 促进根的生长 烟酸 VB3 又称维生素PP 促进胚 的发育 氨基酸培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸糖类 蔗糖 葡萄糖 麦芽 糖 a 为细胞提供合成新物质的碳骨架 b 为细胞的呼吸代谢提供底 物和能量 c 维持渗透压肌醇 环己六醇 肌醇可以形成果胶物质 是细胞壁的构建物质另外还可以形成植酸 与阳离子结合或形成磷 脂 参与细胞膜的组成 利于胚和芽的形成生长调节物质生长素类 促进细胞生长和细胞分 裂 诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力 形成愈伤组织 促进生 根 与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化 侧芽的萌 发与生长 胚状体的诱导 2 4 D 2 4 二氯苯氧乙酸 NAA 萘乙酸 IBA 吲哚丁酸 IAA 吲哚乙 酸 细胞分裂素a 促进细胞的分裂和分化b 诱导芽的分化c 促进侧 芽的萌发和生长d 抑制衰老玉米素 ZT 6 苄基氨基嘌呤 6 BA 激动素 6 糠基氨基嘌呤 KT 赤霉素 GA3 a 诱导茎的细胞伸长b 对形成层 的细胞分化有影响 往往同生长素有协同作用 c 破除种子 鳞茎 块茎休眠 使之提前萌发d 对生长素和细胞分 裂素的活性有增效作用不耐热 应该采用过滤除菌脱落酸 ABA a 抑制蛋白质的合成b 抵消和抑制生长素 细胞分裂素 GA的作用c 诱导休眠 促进衰老和脱落固化剂和悬浮剂琼脂 琼脂糖 聚蔗糖 辅助性物质抗生素 抗氧化物 活性炭水是植物原生质体的组成成 分 也是一切代谢过程的介质和溶媒 培养基种类 1 根据培养物的培养过程 培养基分为初代培养基和继代培养基 2 根据其作用不同 培养基分为诱导培养基 增殖培养基和生根 培养基 3 根据其营养水平不同 培养基可分为基本培养基和完全培养基 动物细胞培养基的组成及其配制 主要成份 氨基酸合成蛋白质 原料 维生素调节生长和代谢 糖类提供碳源和能源 无机盐作为 辅基 维持细胞的渗透压和pH 生长类因子及激素母液配置4植物细 胞工程生长素和分裂素比例高时产生芽 比例低时产生根注意 1 配制倍数不宜过高 可避免浪费 也可避免倍数过高 吸取量 相对少而影响准确性 2 母液配制好后应放在2 4 冰箱内保存 3 母液贮备时间不宜过长 过长时宜出现沉淀和微生物污染 第三章 植物组织与细胞培养的基本原理1 植物组织培养与细胞培养 的区别组织培养从机体内取出组织或细胞 模拟机体内生理条件 在体外进行培养或生长成组织 目的用于植物快速繁殖的组培技术细胞培养植物细胞在体外条件下 的存活或生长 此时细胞不形成组织 目的生产次生代谢物为目的的大规模细胞培养技术 2 植物细胞全能性什么是细胞全能性植物每一个具有完整细胞核的 体细胞 都含有植物体的全部遗传信息 在适当条件下 具有发育 成完整植株的潜在能力 植物细胞具有细胞全能性的原因植物体的全部细胞是经过受精卵的 有丝分裂形成的 受精卵具有本种植物所特有的全部遗传信息细胞 全能性的实现通过细胞脱分化与再分化实现的细胞全能性表达的条 件 1 具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影响下解脱出来 使 其处于独立发育的离体条件下 2 赋予离体细胞一定的刺激细胞全能性实现的途径体细胞性细胞 原生质体细胞融合转基因3 植物细胞分化细胞分化是指由发育起始 状态的合子沿个体发育方向不断分化出形态结构 生理功能不同的 细胞 组织 器官而最终形成完整植株的过程 即由于细胞的分工 而导致其结构和功能改变或发育方式改变的过程 脱分化 Dedifferentiation 也称去分化 指离体条件下生长的细 胞 组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能 而恢复分生状态 形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细 胞的过程 脱分化能力根据细胞类型不同从强到弱 营养生长中心 形成层 薄壁 细胞 厚壁细胞 木质化细胞 特化细胞 筛管 导管细胞 根据 细胞所处的组织不同从强到弱顶端分生组织 居间分生组织 侧生分 生组织 薄壁组织 基本组织 厚角组织 辅导组织 厚壁组织再分 化脱分化后的分生细胞 愈伤组织 在特定的条件下 重新恢复细 胞分化能力 并经历器官发生形成单极性的芽或根 或经历胚胎发 生形成双极性的胚状体 进一步发育成完整植物体的过程 愈伤组织植物受到机械 动物或微生物等伤害后 创伤部位的细胞 脱分化而不断增殖形成松散排列 无特定结构和功能的非器官化组 织 愈伤组织实际上是一种典型的脱分化组织 胚性愈伤组织表面光滑 组织结构紧凑 细胞小 再生力强 非胚性愈伤组织表面粗糙 组织结构疏松 细胞大 诱导期改变原来的分化方向和代谢方式 合成代谢加强 合成大量 蛋白质和核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定基础愈伤组织的形成分 裂期外植体外层细胞开始分裂 细胞脱分化 愈伤组织结构疏松 缺少组织结构 颜色浅而透明分化期1 细胞分裂部位和方向发生改 变 2 分生组织瘤状结构和维管组织形成 3 细胞体积不再减小 4 出现各种类型细胞 5 颜色变化 4 器官发生培养条件下的组织或细胞团 愈伤组织 分化形成不定 根 adventitious roots 不定芽 adventitious shoots 等器官的过程 器官发生方式再生植株的三种方式 可能先长芽后长根 常见 形成根 根上再长出芽 少见 在愈伤组织不同部位分别形成根和芽以上三种方式 可通过器官 直接发生途径 外植体 器官 不定芽 或器官间接发生途径 外植体 愈伤组织 器官 完成高有利于根的形成和愈伤组织的形成 生长 素 细胞分裂素适中有利于根芽的分化 低有利于芽的形成 5 植物 体细胞胚胎 Somatic embryo 体细胞胚或体胚亦称胚状体 embryoid 在体外 由体细胞 非合子细胞 经胚胎发育产生的类似胚胎的结 构 体细胞胚胎的特征 在其发生的最早阶段就具有两极性 即根端 胚根 和茎端 胚芽 并且与母体细胞或外植体的维管束无直接 联系 胚状体一开始就是一个完整植物的雏形 胚状体维管组织的 分布是独立的 Y 字形胚状体可从离体培养的各种外植体上直接或 间接地发生 大致分为五种直接从器官外植体上发生 以叶片为例 愈伤组织发生悬浮培养细胞发生单倍体细胞发生原生质体发生影响 因素氮源铵态氮对胚状体的发生有利 也可同时使用铵态氮和硝态 氮生长调节物质赤霉素 细胞分裂素抑制胚状体发生 生长素类有 利于胚状体的发生组织起源 生理状态 遗传特性 胚状体发生途径 与器官发生途径 不定芽 根 形成植株的区别 胚状体具有两极性 double polarity 即有茎端和根端 器官发生是单极性 胚状体维管组织的分布是独立的 Y 字形 与 外植体组织无结构上的联系 出现所谓的生殖隔离现象 器官发生 中 不定芽一般在愈伤组织的表面 不定根一般发生在愈伤组织较 深的部位 且两者与外植体或愈伤组织的维管组织相联系 胚状体 形成的再生植株遗传性相对稳定 变异性小于由器官发生的植株形 态建成外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化 再分化 产生 芽和根 或形成胚状体 发育成苗或完整植株 6 人工种子通过将植物组织培养中所产生的体细胞胚胎或胚珠等包 埋在人工胚乳和人工种皮里 制成的具有播种功能 类似天然种子 的颗粒人工种子结构胚状体 或芽等 是有生命的物质结构人工种 子人工种皮包裹在最外层的胶质化合物薄膜人工胚乳人工配制的保 证胚状体生长发育需要的营养物质 一般以生成胚状体的培养基为 主 外加一定量的植物激素 抗生素等物质 尽可以提供胚状体正 常萌发所需条件 第四章植物离体无性繁殖和脱病毒技术1 离体无性繁殖 clonal propagationin vitro 又称微繁殖 micropropagation 或离体快繁 rapid vegetativeprogagation 指利用组织培养方法进行将优良植株的茎 尖 腋芽 叶片 鳞片等器官 组织和细胞进行离体 在短期内获 得大量遗传性一致个体的方法 离体无性繁殖的类型腋生枝 axillary branching 型 腋芽萌发 利用外植体上已有的顶芽和腋芽诱导其发 育成枝并培养成苗的繁殖方式 增值率低 变异率小不定芽 adventitious bud 型在顶芽 腋芽以外的任何组织 器官上通过器官发生所形成 无固定着生位置的芽 增值率相对高 变异率相对高体细胞胚 so matic embryo 型指外植体在适宜培养环境中 经诱导产生体细胞产生体细 胞胚 从而形成小植株的繁殖方法 分为间接途径 经愈伤途径 和直接途径两种 增值率最高 变异率小原球茎 protocorm 型部分兰花属于这一类型 即兰花的各个部分的离体组织都能诱导形成原球茎 再经培养分 化形成植株 离体无性繁殖的程序1 无菌培养物的建立2 中间繁殖体的增殖3 完 整植株的形成 生根培养 4 再生植物的驯化和移栽5 再生植株的鉴 定污染 褐变以及玻璃化是离体培养中的三大技术问题 1 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌 导致 培养失败的现象解决办法 在建立培养体系的同时 对初期培养物 要进行严格的检查 除去任何已污染的培养物 对那些缓慢生长或 难以直接观察到的污染的检测 可以利用一些细菌学培养基 通过 微生物方法进行检测 通过采取外植体热处理 取小的茎尖培养或 使用抗生素等方法可以防止外植体带菌引起的污染 2 褐变是指在组织培养中 由于材料被切割而使多酚氧化酶活化 将组织中的酚类物质氧化形成棕褐色的醌类物质 并向培养基扩散 抑制培养物生长甚至导致其死亡的现象 解决方法 向培养基中添加抗氧化剂或吸附剂 用抗氧化剂溶液处 理外植体 或在抗氧化剂溶液中切割 剥离外植体 将褐变外植体 及时地转移到新鲜的培养基上 将培养物置于相对较低温度及黑暗 或弱光条件下 3 玻璃化也称超水化作用 是离体培养过程中试管苗发生的形态 生理和代谢异常的现象 发生玻璃化的苗往往细胞过度吸水 叶片肿胀 扭曲 枝条和叶呈 水浸状 半透明状 脆弱易碎 解决方法 降低细胞分裂素的浓度 调整激素配比 提高培养基中 蔗糖和琼脂的浓度或加入渗透剂 降低培养基渗透势 降低铵态氮 提高硝态氮的含量 改善容器内气体交换状况 降低容器内的相 对湿度 降低培养温度 增加自然光照 在培养基中添加间苯三酚 根皮苷或生长抑制剂等物质 2 植物脱病毒技术病毒在植物体内的扩散 1 通过胞间连丝在植物细胞间短距离移动 2 通过维管束输导组织系统的长距离转移病毒在植物体内的分布 越接近根尖的部分 病毒的含量越低 在根尖 茎尖约0 1 1mm区域 中几乎不含病毒 老叶和成熟组织中病毒含量高 幼嫩和未成熟组 织及器官中病毒含量较低茎尖或根尖部分病毒含量低的原因 这一 区域由分生细胞构成 无维管束 胞间连丝也不发达 病毒很难进 入 分生细胞不断进行活跃的分裂增殖 需要消耗大量的能量 代谢 旺盛 能抑制病毒的复制 茎尖和根尖中内源激素浓度水平较高 抑制病毒复制脱病毒的方 法和原理物理方法高 低温处理 紫外线 X射线照射等化学方法利 用化学物质进行处理生物学方法通过植物组织培养 微型嫁接等除 去病毒的方法 如茎尖分生组织培养 微型嫁接 愈伤组织诱导和 珠心胚培养等 第五章植物细胞培养和次生代谢产物生产1 植物细胞培养 plant cellculture 是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行 培养并使其增殖 获得大量细胞群体的一种技术 2 植物单细胞分离由完整的植物器官中分离单细胞机械法指通过机 械磨碎 切割植物体从而获得游离的单细胞 细胞不受到酶的伤害 不用质壁分离 细胞产量低 细胞 易破 酶解法指用专一的水解酶 纤维素酶 果胶酶 琼脂酶等 在温和条 件下分解胞间层 分离细胞 细胞受到酶的伤害 要质壁分离 细胞产量高 细胞不易 破由培养组织分离单细胞从培养的未分化的且疏松易碎的愈伤组织 中分离单细胞3 植物单细胞的培养技术平板培养植板率是能长出细 胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例 看护培养和饲养层培养看护培养是指用一块活跃生长的愈伤组织来 促进培养细胞持续分裂和增殖的培养方法 饲养层培养用处理过的 无活性或分裂慢的细胞来饲养所需培养的 细胞 使其分裂和生长 液体浅层静置培养法将一定密度悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄 层封口静止培养 细胞悬浮培养法细胞接种于液体培养基中 在保持良好的分散状态 下培养 微室培养在人工制造的无菌小室中 将一滴悬浮细胞液培养在少量 培养基上 使其分裂增殖形成细胞团的方法4 植物细胞的大规模培 养 p89 p95 悬浮培养分批培养 连续培养 半连续培养固定化培养包埋法 吸附法植物细胞大规模悬浮培养的优点1 可以增加培养细胞与培 养液的接触面 促进营养吸收 2 可带走培养物产生的有害代谢产物 避免高浓度积聚对细胞的伤 害 3 保证良好的混合状态 从而获得良好的气体传递效果细胞同步化 synchronization 是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过 细胞周期的某一特定时期 使细胞保持相对一致的细胞学和生理学 状态 便于研究细胞分裂和细胞代谢 细胞固定化定义 将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网 状支持物中 培养液呈流动状态 进行无菌培养的一种技术 细胞固定化具有以下意义1 细胞生长较慢 有利于次生代谢物的积 累 2 易控制化学环境 收获次生代谢产物 3 细胞经包埋后受剪切力损伤小 4 有利于进行连续培养和生物转化 5 影响次生代谢产物的因素1 生物因素细胞株 细胞凋亡 细胞团 生物合成机制2 化学因素营养盐 前体 诱导子 反馈抑制3 物理因素光照 温度 PH4 工程技术问题培养液的流变特性 气体 传递 搅拌与剪切力 泡沫与器壁表面粘附性提高次生代谢产物产 量的途径1 培养设备选择或设计合适的生物反应器 2 培养工艺诱导子添加 前体喂养 添加竞争途径代谢产物抑制剂 培养条件 培养基 环境条件 优化与控制 流加培养 起始材 料的选择 3 培养技术固定化培养技术 两相培养技术 两步法培养 第1步 细胞生长 第2步产物积累 毛状根培养技术 冠瘿培养技术 反 义技术 6 植物细胞生物反应器 Plant cellbioreactor 是指用于植物细胞批量化培养的装置及其相应控 制系统 要求具有适宜的氧传递 良好的流动性和较低的剪切力 根据大规模培养方法主要分为悬浮培养生物反应器和固定化培养生 物反应器两种 7 初级代谢产物 Primary metabolites 是通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质 如氨基酸 核苷酸 多糖 脂类等 8 次级代谢产物 Secondary metabolites 是通过次级代谢合成的产物 是指植物中一大类并非 植物生长发育所必需的小分子有机化合物 其产生和分布通常有种 属 器官组织和生长发育期的特异性 例如抗生素 激素 生物碱 毒素等 9 植物细胞大规模培养生产次生代谢物的基本程序 1 诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系 2 筛选高产细胞系 株 3 在生物反应器中进行大规模培养 获得所需次生代谢物 10 细胞系 Cell line 是由原代培养经传代培养纯化 获得的以一种细胞为主的 能 在体外长期生存的不均一的细胞群体 11 细胞株 Cell strain 是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通 过筛选的方法 由单细胞增殖形成的细胞群 再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群 亦可称 之为亚株 Substrain 12 前体 precursor 指某一代谢中间体的前一阶段的物质 一般在生物合成反应的中间过程中 某一阶段前的物质 都可以说 是该阶段物质的前体物质 第六章植物原生质体培养和体细胞杂交1 原生质体 protoplast 指 将植物细胞壁去掉后得到的裸露的有生命力的球形细胞体细胞杂交 somatic hybridization 又称为原生质体融合 protoplast fusion 是指在人工控制条件下 不经过有性过程 两种体细胞原 生质体相互融合产生杂种细胞 并使之分化再生 形成新物种或新品 种的技术 2 原生质体分离1 材料植物幼嫩的叶片 无菌实生苗的子叶和下胚 轴 外植体的愈伤组织和悬浮细胞系 花粉细胞2 材料的预处理用 黑暗处理 低温处理和不同光质照射等方法 可提高某些材料原生 质体的产量和活力 3 酶的种类及酶液配制4 分离机械分离法先将细胞放在高渗糖溶液 中预处理 待细胞发生轻微质壁分离 原生质体收缩成球形后 再 用机械法磨碎组织 从伤口处可释放出完整的原生质体 酶解分离法指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定 时间 在酶液的作用下 细胞壁被降解 从而获得大量有活力的原 生质体的方法 原生质体的纯化1 过滤 离心法 利用比重原理 在具有一定渗透压的溶液中 先进行过滤然 后低速离心 使纯净完整的原生质体沉积于试管底部 2 漂浮法 采用比原生质体密度大的高渗溶液 蔗糖 Percoll Fic oll 使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法 3 界面法 又称不连续梯度法 采用两种密度不同的溶液形成不连续 梯度 通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中 从而 纯化原生质体的方法 可以收集到数量较大的纯净原生质体 同时避免收集过程中原生质 体因相互挤压而破碎原生质体活力测定1 形态识别法形态完整 富 含细胞质 颜色新鲜的正常球形 放入低渗溶液中 可正常膨大 2 染色法荧光显微镜识别 FDA法 紫外线照射时 有活力的原生体 体可以被染色酚藏花红染色法 0 1 酚藏花红能使无活力的原生质 体染成红色 有活力的原生质体不着色 伊凡蓝 Evan s blue 染色法 0 025 有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种 染料 活细胞不摄取 3 细胞质环流法和氧电极法原生质体培养获得有活力的原生质体后 应用合适的方法 在适当的培养条件下 可使原生质体再生出新 的细胞壁 接着细胞进行持续分裂形成细胞团 并培养形成愈伤组 织或胚状体 分或或发育成苗 最后形成完整的再生植株 1 液体浅层培养2 固体平板培养3 液体 固体双层培养法3 植株再生过程 1 细胞壁再生 细胞壁再生是细胞分裂的先决条件 2 细胞分裂 3 植株再生4 体细胞杂交体细胞杂交意义 1 实现远缘杂交 形成新的物种 2 创造细胞质杂种 3 培育作物新种质和新品种原生质体融合的方法1 自发融合同种 细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并 称自发融合 2 诱发融 合指将植物原生质体制备出来后 再加入诱导剂或用其他方法促使 两亲本原生质体融合的方法 A化学诱导融合利用化学融合剂 促使原生质体相互靠近 粘连融合 的方法 B电诱导融合法 利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串 再施 以瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法 第七章植物花药和花粉培养及单倍体育种1 植物花药培养与花粉培养花药培养 anther culture 将发育到一定阶段的花药剥离下来 切去花丝部分 接种到 培养基上进行培养 最终形成完整植株的过程 属于器官培养 花粉培养 pollen culture 又称小孢子培养 microspore culture 或游离小孢子培养 isolated microsporeculture 是指在无菌条件下 将花粉从花药中游离出 来 使其分散或游离态 发育成单倍体植株的过程 属于细胞培养 花药培养 138 143 1 培养材料的选择2 材料的预处理 对花药进行适度的逆境处 理 包括低温 高温 化学物质 离心 射线 3 外植体消毒4 接 种5 培养6 植株再生 器官发生 胚胎发生 7 生根8 驯化与移栽9 单倍体植株的染色体加倍杂种植株融合的原生质人再生出脱分化愈 伤组织再分化植物细胞的融合植物组织培养植物细胞A原生质体B原 生质体A杂种细胞去壁去壁工诱导方法 促进融合融合完成的标志植 物细胞B花粉培养1 花粉的收集1 机械挤压法挤压法是将花药消毒 后 加入少量的分离溶液 用镊子或小玻璃棒将花粉从花药中挤压 出来 通过不锈钢网或尼龙网筛去组织碎片 收集悬浮液 然后用3 0 蔗糖离心收取悬浮在蔗糖溶液上层的完整花粉粒 再用培养基洗 涤几次后用于培养 研磨过滤收集法在无菌条件下 将采集到的花蕾经表面消毒后剥离 出花药 再将花药置于无菌的研钵中研磨并挤出小孢子 同时滤去 药壁等大的组织碎片 经离心收集后接种于适宜培养基上进行培养 的方法 2 自然散落法将花药接种于液体培养中 使花粉自然释放 再进行 收集培养 3 机械游离法 主要有磁搅拌法和小型搅拌法 磁搅拌法利用机械力使花药壁破裂至花粉溢出的方法 小型搅拌法又称超速旋切法 是通过转轴的高速转动带动花蕾 穗 子切段或花药高速运动而使之破裂 从而使小孢子游离出业 经过 分级过筛收集后进行培养2 花粉的培养平板培养花粉置琼脂固化培 养基上培养 液体培养花粉悬浮在液体培养基中培养 需震荡 以利通气 双层培养花粉置固体 液体双层培养基上培养 培养基制作方法先铺一层琼脂固体培养基 凝固后 在表面加入少 量液体培养基 看护培养利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢 子发育 微室培养利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养条件 培养利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上 培养 花药条件培养基 子房条件培养等 两者之间的异同 1 培养目的相同 均获得小孢子植株 2 花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分 就培养方法 和技术来讲 属于器官培养 而花粉培养属于细胞培养 3 花粉培养没有药壁组织干扰 可计数小孢子产胚率 可观察雄 核发育的全过程 单倍体产量高 但技术更复杂影响花药培养和花粉培养的因素1 基因型不同基因型 的培养难易及植株再生有很大差别 2 植株的生理状态和环境条件母体植株的年龄和所经历的环境条件 如光周期 光照强度 温度等对以后的花粉离体培养有很大影响 一般田间比温室 幼龄比老龄植株易于培养 3 花粉的发育时期只有发育到某一时期的花粉对离体刺激才最敏感 因此选择合适的花粉发育时期的花药很关键 多数植物单核期的花 粉培养容易成功 4 培养基基因型不同 所需培养基种类 蔗糖浓度以及添加激素种 类和浓度不同 加入活性炭可提高花粉植株的诱导率 花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用 但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育5 预处理花粉或花 药从植株上取下来直接培养 往往诱导频率极低 采用低温 高温 离心等预处理方法可以促进花粉启动 提高再生频率 6 培养条件 接种密度2 根据小孢子最初几次分裂方式的不同1 小孢子 均等细胞 发育途径 途径 单核小孢子有丝分裂形成2个 等同的子细胞2 营养细胞发育途径 途径 单核小孢子进行一次 正常的非均等分裂后 营养细胞继续分裂3 生殖细胞发育途径 途 径 单核小孢子进行一次正常的非均等分裂后 生殖细胞继续分 裂4 生殖细胞和营养细胞 不均等细胞 发育途径 途径 单核小 孢子进行非均等分裂后 生殖细胞和营养细胞均继续分裂 参与孢 子体的形成 3 单倍体植株倍性鉴定 原因诱导效率低 且获得的花粉植株是混 合群体 1 直接鉴定也叫染色体直接计数法 通常取根尖 茎尖等 分生组织区进行制片 直接计数染色体数目 2 间接鉴定扫描细胞光度仪鉴定 流式细胞仪 主要测定叶片单个 细胞中DNA的含量确定细胞的倍性 材料的使用量可少到1cm2 细胞形态学鉴定法叶片保卫细胞大小 单位面积上的气孔数及保卫 细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性 植株形态学鉴定法单倍体植株瘦弱 叶片窄小 花小柱头长 花粉 粒小 不结实 DNA含量测定核体积测量法生化与分子标记鉴定4 染色体加倍单倍 体植株进行加倍主要采用化学诱变法 常用的诱导剂包括秋水仙素 8 羟基喹啉 对二氯苯等 其中秋水仙素最好5单倍体 haploid 指细胞中含有正常体细胞的一 半染色体数 即具有配子染色体数目的个体 单倍体育种 haploid breeding 指将具有单套染色体的单倍体植物 经人工染色体加倍 离体条件下小孢子发育成植物体的途径使其成为纯合二倍体 从中选出具有优良性状的个体 直接繁育成新品种 或选出具有单 一优良性状的个体 作为杂交育种的原理材料 第八章植物胚胎培养1植物胚胎培养 Embryo Culture 指对植物的胚 子房 胚珠和胚乳进行离体培养 使其 发育成完整植物的技术 包括胚培养 embryo culture 成熟胚培养 幼胚培养 胚珠培养 ovule culture 子房培养 ovary culture 胚乳培养 endosperm culture 离体受精 in vitropollination 等类型 1 胚培养指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来 置于培养 基上进行培养 成熟胚培养指子叶期至发育成熟的胚培养 成熟胚是自养的 培养基需要简单 仅提供一定的温度 湿度就可以发芽生成植物体 幼胚培养是指处于原胚期 球形期 心形期 鱼雷期的胚培养 幼 胚完全是异养的 离体条件下培养要求培养基成分复杂 培养不易 成功 2 胚乳培养是指将胚乳组织从母体上分离出来 通过离体培养 使 其发育成完整植株被子植物胚乳是由2个单倍的极核和1个单倍的精 子结合而成的3倍体组织 由它可获得无子结实的3倍体植株 裸子植物很特殊 它的胚乳在受精前就已形成 裸子植物的胚乳为配子体的一部分 由大孢子直接分裂发育而成 因此是单倍体组织 3 胚珠和子房培养胚珠培养将胚珠从母株中分离出来 放在无菌的 人工环境条件下 让其进一步生长发育 以致形成幼苗的过程 根据胚珠是否受精分为受精胚珠的培养和未受精胚珠的培养子房培 养将子房从母株上摘下 放在无菌的人工环境条件下 让其进一步 生长发育 以至形成幼苗的过程 包括授粉子房和未授粉子房培养 4 离体授粉与离体受精离体授粉技术将未授粉的离体胚珠或子房接 种在培养上 然后在试管内撒播花粉 花粉发芽后 花粉管长入胚珠内受精 受精后的胚珠进一步发育成种子 离体受精技术在离体条件下完成被子植物精 卵融合 并将受精所 所生的 人工合子 培养成再生植株动物细胞工程基础第十二章动 物细胞培养技术 1 动物细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织或器官取出 模拟动物体内的生理条件 在体外进行培养 并观察细胞的生长 发育及衰老等生命现象的技术 优点 1 直接观察细胞的生长 发育过程及细胞内结构 2 可以人为控制培养条件 包括温度 pH值等 3 可以研究各种物理 化学等外界因素对细胞的生长发育和分化的 影响不足 组织或者细胞离体以后 体外培养与体内环境相比有一定 的差异 体外培养还不能完全模拟体内的生长情况 2 体外培养物的细胞学特性 1 生物学特性的两重性相似性 培养细胞的基本生物学特征与体 内细胞类似差异性 细胞离体以后 失去了神经和体液调节以及细胞 间的相互影响 分化减弱 功能趋向单一化 出现衰退死亡 恶性 化等现象 2 培养细胞分化状态的变化分化 differentiation 在个体发育 中 细胞后代在形态结构和功能上发生稳定性差异过程称为细胞分 化 去分化 dedifferentiation 各种分化细胞 逐渐失去各自的形态与 功能特性 表现出某种趋同性的过程 也叫脱分化 3体外培养细胞的形态贴附型细胞 非贴附型细胞 悬浮型细胞 接 触抑制细胞从接种到长满底物表面后 由于细胞繁殖数量增多相互 接触后 不再增加 密度抑制细胞密度增大 培养液中营养减少 代谢产物增多 导致 细胞不在增加4 培养细胞生命期细胞在体外培养条件下持续增殖和 生长的时间 原代培养期 传代期 衰退期 培养细胞的一代生存 期从细胞接种到分离再培养的时间原代培养亦称初代培养 指将机 体取出的细胞或组织进行实效培养的过程 原代细胞指实效培养的细胞大约增殖10代左右 称为原代细胞 继代培养亦称传代培养 从原代培养的细胞继续转接培养称继代培 养 细胞系指由初代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群 5 动物细胞体外培养技术体外培养的特点 1 营养需求更苛刻 2 环境要求更高 3 易污染因动物细胞培养时间长培养条件1 温度最适温度37 2 pH最适为7 2 7 43 气体需要O 2 CO2 4 营养要求高 需要氨基酸 维生素 辅酶 核酸 激素 生长因子等 6 动物细胞培养中血清的作用1 提供对维持细胞指数生长的激素 基础培养基中没有或量很少的营养物 以及主要的低分子营养物 2 提供结合蛋白 能识别维生素 脂类 金属和其他激素等 能结 合或调变它们所结合的物质活力 3 有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合 起到解毒作 用 4 是细胞贴壁 铺展在塑料培养基质上所需因子 5 起酸碱度缓冲液作用 6 提供蛋白酶抑制剂 使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活 保护 细胞不受伤害 7 培养基必须具有下述基本条件 1 营养物质培养基必须供给活细胞所需要的全部盐类 2 缓冲能力培养基必须合有非毒性的缓冲液 而且pH值在pH7 0 7 2之间 3 等渗性溶解于培养基的物质浓度产生的等渗性必须与细胞内的液 体一致 4 无菌培养基不能有微生物 利用培养基繁殖起来的微生物会破坏 培养的活细胞 动物细胞培养培养基种类为天然培养基 合成培养基 无血清培养 基 动物细胞培养必需的溶液动物细胞培养的传统方法悬滴培养法 旋转管培养法 灌注小室培养法 培养瓶培养方法 培养板培养 法 8 细胞保存 1 冷冻速率是指降温的速度 是活细胞能否被冷冻到一个能永久 保存的温度的一个主要因素 2 复温速率是指细胞复苏时温度升高的速度 3 目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类 具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内 一般是一些小分子的 物质 主要有甘油 DMSO 乙二醇 丙二醇 乙酰胺 甲醇等 非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内 一般是些大分子物质 主 要有聚乙烯吡咯烷酮 PVP 蔗糖 聚乙二醇 羟乙基淀粉等 4 冷冻保存温度是指能长久保存细胞的一个深低温度 5 冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质 常被加到一 定的溶液中进行配制 作为冷冻保护液 9 动物细胞大规模培养技术悬浮培养技术 微载体培养技术 多孔 载体培养 微囊化培养技术 中空纤维法 10 微载体培养系统原理利用固体小颗粒作为载体 细胞附着之 通过连续搅拌悬浮于培养液中 由于扩大了细胞的附着面 提高了细胞的生长效率和产量 微载体是由天然葡萄糖聚合物 葡聚糖 或者各种合成的聚合物组 成的 11 器官培养取出动物器官或进一步修整成器官型植块 将其培养 使其存活和生长的过程 器官培养的共同点1 培养对象为胚胎组织的某一器官或非胚胎组织 器官的一部分2 被培养对象浸泡在培养液中3 培养器官从培养液 中获氧及养料 同时排废物器官培养特征1 被培养的器官在体外存 活较长时间 并保存相对正常的功能 器官内的细胞有正常的代谢 甚至增殖 而器官保存无细胞增殖2 被培养物为一完整器官或具有完整功能的 某一器官的一部分 如肝3 器官培养不能从一个变成多个 而细胞 培养过程中有细胞量的增加第十三章细胞融合 1 细胞融合又称体细胞杂交 是指将不同的原生质体相融合并使之 分化再生 形成新物种或新品种的技术 根据融合时细胞的完整程度 原生质体融合可分为两大类对称融合 asymmetric fusion 即两个完整的细胞原生质体融合 非对称融合 symmetric fusion 利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进 行融合 细胞融合意义 1 有性杂交变无性杂交 加快育种速度2 进行体细胞融合可打破远缘杂交的不亲和性培育远缘杂交新种3 创 造新细胞质杂种 如细胞质雄性不育 抗除草剂4 制备单克隆抗体 植物育种中的核质替换和细胞器的互作研究细胞融合的一些基本 概念基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体 不同基因型 的杂交细胞则称为异核体同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发 合并 称自发融合 异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合 称 诱发融合主要过程细胞相互靠近 细胞桥形成 胞质渗透 细胞核 融合 2 细胞融合技术 1 生物法 仙台病毒法 HVJ 仙台病毒属于黏液病毒副流感类群 是RNA病毒 多型颗粒状 易在小鼠中蔓延 仙台病毒促细胞融合的有效部位是膜 促细胞融合的因素是病毒被 膜上的磷脂成分 病毒促使细胞融合的主要步骤1 两个原生质体或细胞在病毒黏结作 用下彼此靠近 2 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜互相渗透 胞 质相互渗透 3 两个原生质体的细胞核互相融合 融为一体 4 进入正常的细胞分裂途径 分裂成含有两种染色体的杂种子细胞 2 化学法 PEG结合高pH 高Ca 诱导法1 基本原理聚乙二醇 PEG 是一种多 聚化合物 可能的原因大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离 子的连接下形成静电键 促使异源的原生质体间的黏着而结合 用 高Ca2 和pH溶液将与质膜结合的PEG分子进行洗脱 导致电荷平衡 失调并重新分配 使两种原生质体上的正电荷连接起来 进而形成 具有共同质膜的融合体 3 物理法 电融合诱导法1 基本原理在直流电脉冲的诱导下 原生质体质膜表 面的电荷和氧化还原电位发生改变 使异种原生质体黏合并发生质 膜瞬间破裂 进而闭合成完整的膜形成融合体 2 电融合的基本过程细胞膜的接触当原生质体置于电导率很低的溶 液中时 电场通电后 电流即通过原生质体而不是通过溶液 其结 果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子 从而使原生质体紧 密接触排列成串 膜的击穿原生质体成串排列