酶工程2016

酶工程专题泰州职业技术学院 徐坤山,2017/12/9,1,酶的古典定义：酶是活细胞合成的具有催化活性的蛋白质，酶是生物催化剂。核酶：是具有催化活性的核酸，核酶也是生物催化剂。课堂讨论：有学者将酶定义为生物催化剂，包括具有催化功能的蛋白质和核酸。但是也有学者认为为了加以区别，就把具有催化功能的蛋白质定义为酶，而具有催化功能的核酸定义为核酶。你的观点是？酶的作用特点：高效性 （高度的催化效能）专一性 （对底物的选择性）不稳定性（容易失活）,2017/12/9,2,一、概述,酶工程：是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。酶工程的主要内容：酶制剂的生产：如微生物酶的发酵和提取，动植物中酶的提取及鉴定技术等酶分子修饰改造酶的固定化、细胞的固定化酶反应器的研制和应用 其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。,2017/12/9,3,一、概述,二、酶的发酵生产,2017/12/9,4,商业用酶的来源：植物：如淀粉酶、木瓜蛋白酶等动物：如胰酶、凝乳酶、尿激酶等微生物：酶工业化生产的主要来源。微生物生长繁殖快、周期短、产量高微生物培养方法简单、经济微生物菌株种类多，酶的品种多微生物高产产酶菌种培育相对容易,优良产酶菌种的标准生产周期短，易培养培养原料廉价易得产酶性能稳定，产量高，不易变异退化、不易感染噬菌体产生的酶容易分离纯化，最好产生的是胞外酶不是致病菌，安全可靠。,2017/12/9,5,二、酶的发酵生产,常用的产酶菌：E.coli ：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶。枯草杆菌：主要用于生产-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等,2017/12/9,6,二、酶的发酵生产,课堂讨论：有些生物学家热衷于研究极端环境下的微生物，其可能的意义是什么？,酶的发酵生产工艺条件：培养基：碳源、氮源、无机盐、生长因子、PH。发酵工艺参数控制：温度控制通气与搅拌PH控制提高酶产量的措施添加诱导物控制阻遏物浓度添加表面活性剂添加产酶促进剂,2017/12/9,7,二、酶的发酵生产,课堂讨论：在有关菌种培养条件优化的研究方案中在培养基中加入吐温或EDTA，有何意义。,酶的分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。,8,三、酶的分离纯化,三、酶的分离纯化,（一） 细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎,JY92-II D超声波细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,9,胞外酶不需要进行细胞破碎处理！,细胞破碎要防止酶失活,采用缓冲体系：防PH大幅度变化而失活添加保护剂：防止活性基团（活性中心）受影响抑制蛋白酶的活性其他保护措施：温度，PH，搅拌，光照，氧化等影响,10,（二）酶的抽提,11,(三）沉淀分离,12,四、 酶的固定化,（一）固定化酶的制备1、固定化酶（immobilized enzyme）的定义:指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。,13,2、固定化酶的特点,可以多次使用，酶的稳定性提高；反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；比水溶性酶更适合于多酶反应。,14,15,3、酶和细胞的固定化技术,（1）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。A.物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。如活性碳,多孔玻璃,树脂等优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。,16,B、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。如：DEAE-纤维素等优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响，离子强度高时，酶易脱落。,17,C、共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应。,18,（2）交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。,19,（3）包埋法：,A、网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞,20,B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。,21,（3）包埋法：,(二)固定化酶的性质酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶分子处在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会影响酶原有的性质。微环境的化学组成与酶相结合的表面结构底物进入与底物排出微环境的速度微环境的局部pH,2017/12/9,22,1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。1973年，日本首次在工业上成功地应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。,2017/12/9,23,（三）固定化酶应用实例,1976年，法国首次用固定化枯草杆菌细胞生产啤酒和酒精。l978年，日本用固定化枯草杆菌细胞生产-淀粉酶的研究成功，开始了用固定化细胞生产酶的先例。郭勇等人从l984年开始，在国内首次进行固定化细胞生产-淀粉酶、糖化酶和果胶酶等的研究，取得良好效果。,2017/12/9,24,（三）固定化酶应用实例,固定化酶可做成“人工脏器”参与体外循环。如人工肾，一种替代肾脏功能的装置，主要用于治疗肾功能衰竭和尿毒症。,2017/12/9,25,（三）固定化酶应用实例,世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶,用来生产一种重要的甜味剂-果葡糖浆。此固定化酶在国内外均进行过广泛的研究和应用，1973年就已用于工业化生产。,2017/12/9,26,（三）固定化酶应用实例,固定化青霉素酰化酶：是在药物生产中广泛应用的一种固定化酶。可用多种方法固定化。1973年已用于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头孢菌素。用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变pH等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)或7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)，也可以催化6-APA或7-ACA与其他的羧酸衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基团的青霉素或头孢霉素。,2017/12/9,27,（三）固定化酶应用实例,固定化青霉素酰化酶：,2017/12/9,28,（三）固定化酶应用实例,工艺技术路线： E.Coli 斜面 细胞 固定化细胞 青霉素G 转化液 滤液 6-APA 粗品,培养,固定,转化,过滤,抽提,29,青霉素酰化酶转化流程图,30,三、酶传感器,（一）原理：酶催化特定底物发生反应,从而使特定生成物的量有所增减.用能把这类物质的量的改变转换为电信号的装置和固定化酶耦合,即组成酶传感器.酶传感器是一类生物传感器。,31,葡萄糖氧化酶电极,葡萄糖氧化酶电极可用于测定葡萄糖含量1967年Updick和Hicks将固定化的葡萄糖氧化酶膜结合在氧电极上,做成了第一支葡萄糖电极。以后人们不断研究和改进葡萄糖氧化酶电极。基本原理：葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成葡萄糖内酯和H2O2；在检测范围内，被测定葡萄糖浓度与葡萄糖氧化酶催化作用产生的生物量指标相关：H2O2产生速率O2消耗速率电子传递量,