分光光度法测定化妆品中的氨基酸.doc

.摘要采用分光光度法对化妆品中氨基酸含量的测定了研究探讨。氨基酸的氨基与茚三酮水合物反应可生成蓝紫色化合物，该化合物最大吸收峰在568nm 波长处，且此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨基成正比，因此可作为氨基酸定量分析方法。该方法简便、灵敏、快速重现性良好，可用于化妆品的产品检验方法。13,14关键词：化妆品；总氨基酸；分光光度法；含量测定目录1 前言 41.1 氨基酸的分类 41.2 氨基酸的应用 .51.2.1 在食品行业的应用 51.2.2 在医药工业的应用 51.2.3 在饲料添加剂行业的应用 51.2.4 在化妆品行业的应用 51.2.5 在农业上的应用61.2.6 在其他行业的应用61.3 氨基酸含量的测定方法 61.3.1 化学法 61.3.1.1 甲醛滴定法 61.3.1.2 凯氏定氮法 61.3.2 分光光度法 71.3.3.3 纸色谱法和薄层色谱法 713.3.4 气相色谱法 71.3.3. 5 液相色谱法 71.3.3.6 毛细管电泳色谱法 81.3.3.7 电化学法 82 材料与方法 92.1 实验原理 92.2 实验试剂及仪器 92.2.1 主要试剂 92.2.2 主要仪器 92.3 溶液的配制 92.4 实验方法 102.4.1 测量波长的选择 102.4.2 显色时间的考察 102.4.3 标准曲线的绘制 102.4.4 样品氨基酸的提取 102.4.5 样品中氨基酸含量测定 103 结果与讨论 103.1 测量波长的选择 103.2 显色时间的考察 113.3 标准曲线的绘制 113.4 样品氨基酸含量的测定 123.5 注意事项 13总结13致谢14参考文献 15分光光度法测定化妆品中的氨基酸1 前言化妆品是清洁、保护、美化人体面部、皮肤及毛发等的日用化学品，具有令人愉快的香气，能使人的容貌整洁美观，并有益于身心健康。化妆品的种类繁多，性能各异，其分类方法很多。按应用部位进行分类，可分为：皮肤用化妆品、毛发用化妆品、指甲用化妆品和唇膏。随着人们生活水平的不断提高，市场的日益繁荣，化妆品在人们的日常生活中已得到广泛的应用。化妆品是由各种作用不同的原料，经过配制加工而成的复杂混合物，必须采用合理的配料和加工工艺，把种原料有效地加以组合，形成一定的形态，才能充分发挥各种原料所具有的特性和功能。制造化品所需要的原料品种繁多，根据其用途和性能，大体上可分为基质原料和配合原料(辅助原料)两大类。基质原料是组成化妆品的主体，也是在化妆品中起主要作用的物质；配合原料是使化妆品型、稳定或赋予色、香及其他特殊作用的原料，这些原料虽然用量不大，但极为重要1,17。目前，市场上许多食品(保健品)中富含氨基酸类成分，其中以丙氨酸含量最高。丙氨酸是一种氨基酸，化学式alanine，简写为ala，在氨基酸序列中可简写为A。对人体来说，丙氨酸为必需氨基酸。但长期以来，质检系统缺乏对该类产品进行系统性检验研究。本试验模仿市场上含中药类食品、保健品的产品工艺，采用分光光度法测定该类制品中的氨基酸含量18。本法所采用的强酸性阳离子交换树脂柱将样品中的氨基酸盐置换为氨基酸。实验证明，采用分光光度法检测含氨基酸类制品的检验方法是可行的。该法精密度高，抗干扰性强。此项技术在目食品监管中具有十分普遍的意义。由于方法简单易行，几乎可以在一般实验室使用。1.1 氨基酸的分类氨基酸（amino acids）广义上是指既含有一个碱性氨基又含有一个酸性羧基的有机化合物，正如它的名字所说的那样。但一般的氨基酸，则是指构成蛋白质的结构单位。在生物界中，构成天然蛋白质的氨基酸具有其特定的结构特点，即其氨基直接连接在-碳原子上，这种氨基酸被称为-氨基酸。-氨基酸是肽和蛋白质的构件分子，在自然界中共有20种。除-氨基酸外，细胞还含有其他氨基酸。氨基酸是构成生命大厦的基本砖石之一。 1.2 氨基酸的应用13,14氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是动物体合成蛋白质的原料来源，属食品、饲料的营养成分，在医学上具有防病治病的作用，也可作为营养型化妆品的有效成分及合成药物、表面活性剂、其他工业产品的化工原料。因此，氨基酸分析是工业、农业生产及生命科学研究中最重要的技术之一。广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术业的发展逐渐成为21世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61 ，在饮料工业占30 ，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。1.2.1 在食品行业的应用 谷氨酸钠是人类应用的第一个氨基酸，也是世界上应用范围最广、产销量最的种氨基酸。后来人们已陆续发现甘氨酸、丙氨酸、脯酸、天冬氨酸也具有调味作用，并将之应用于食品行业。1.2.2 在医药工业的应用 氨基酸是合成人体蛋白质、激素、酶及抗体的原料，在人体内参与正常的代谢和生理活动。用氨基酸及其衍生物可治疗各种疾病，可作为营养剂、代谢改良剂，具有抗溃疡、防辐射、抗菌、治癌、催眠、镇痛及为特殊病人配制特殊膳食的功效。如氨基酸的混合液可供病人注射用，氨基酸的混合粉可作宇航员、飞行员的补品。1.2.3 在饲料添加剂行业的应用 在饲料添加剂行业用的氨基酸主要有蛋氨酸和赖氨酸。其功效主要是：促进动物生长发育；改善肉质，提高畜禽生产能力，增加产量；提高饲料利用率，节省蛋白质饲料；降低成本。如蛋氨酸主要用于鸡饲料，亦可用于猪、牛的混合饲料。又如，赖氨酸具有增强畜禽食欲、提高抗病能力、促进外伤治愈的作用。1.2.4 在化妆品行业的应用 氨基酸及其衍生物易被皮肤吸收，使老化和硬化的表皮恢复弹性，延缓皮肤衰老，具有保水、抗菌、缓冲、表面活性剂保护作用,以及某些有利机体的生理作用。如氨基酸和高级脂肪酸制成的表面活性剂、抗菌剂，已成为最高效的添加剂而被广泛应用；氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸的碳酸盐、聚天门冬氨酸等制成的护发剂、染发剂，发展成为时兴商品供应市场由于氨基酸具有促进美肤功能, 目前化妆品界应用为保湿剂的氨基酸，有小分子量氨基酸（Aminoacid）以及大分子量的氨基酸聚合体（Polypetide）。 属于氨基酸类的保湿剂有蛋白类，例如植物蛋白、大豆蛋白、动物蛋白、水解蛋白等。这一类保湿剂的来源成本较高，所以被视为较珍贵的保湿剂。 1.2.5 在农业上的应用 一些氨基酸在体外并无杀菌功能，但它们能干扰植物与病原菌之间的生化关系，使植物的代谢及抗病能力发生变化，从而达到杀菌的目的。例如苯丙氨酸和丙氨酸可用于治疗苹果疮痂病。又如，美国一家公司用甘氨酸制成了除草剂，这类农药易被微生物分解，不易造成环境污染。1.2.6 在其他行业的应用 在生物工程方面，半胱氨酸等正被开发成新的保护剂；亮氨酸、胱氨酸等正作为发酵工业中多种氨基酸生产菌的添加剂而被应用。在轻工业方面，聚谷氨酸和聚丙氨酸用于具有良好保温性和透气性的人造皮革和高级人造纤维的生产。在重金属提取和电镀工业方面，天门冬氨酸、组氨酸、丝氨酸有重要的应用；谷氨酸等可用于电镀工业的电解溶液，半胱氨酸可用于铜矿探测，氨基酸烷基酯可用于海流油回收等。1.3 氨基酸含量的测定方法71.3.1 化学法1.3.1.1 甲醛滴定法原理：是在中性或弱碱性水溶液中，- 氨基酸与甲醛反应生成亚甲基亚氨基衍生物,亚基亚氨基衍生物用碱滴定，从而得到样品中总氨基酸的含量1。特点：此法简单易行、快速方便，但准确度差，终点较难掌握。1.3.1.2 凯氏定氮法原理：通过测定样品中总氮的含量，然后根据蛋白质和氨基酸中的氮含量，得知含氮的氨基酸、蛋白质的总量。常见的方法有常量法、微量法、自动定氮法、半微量法及改良凯氏法等多种2。特点：该方法准确度高，但操作步骤复杂、试剂耗量多、测定周期长。1.3.2 分光光度法原理：分光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。大部分氨基酸在紫外区无吸收，只有小部分在紫外区有吸收，而且吸收光谱严重重叠，所以，对大部分氨基酸不经分离而用紫外分光光度法同时测定，需要采用一定的数学方法3。目前常用的数学分光光度法有偏最小二乘法分光光度法、多元线性回归分析分光光度法等方法。1.3.3 色谱法1.3.3.3 纸色谱法和薄层色谱法纸色谱法原理：以纸为载体，纸所吸附的水为固定相，展开剂为流动相，由于样品成分在两相溶剂中的分配系数不同而实现分离，按操作方法分为垂直型和水平型两类4。运用纸色谱法采用不同的层析液和检测用显色剂，可以对三十多种氨基酸及其衍生物行分析。纸色谱点是操作简单、分离效能较高、所需仪器设备廉价，因而应用广泛。纸色谱电泳相结合可以对氨基酸进行进一步的分离薄层色谱法原理：根据各种氨基酸在吸附剂表面的吸附能力不进行分离或提纯的一种方法，常用的薄层板有硅胶、聚酰胺纤维素，采用相应的展开对氨进行分离，然后分别采用紫外光荧光或可光进行检测5。特点：具有展开快、分离效能高、灵度高、耐腐蚀等特点，比纸色谱的应用更广泛。13.3.4 气相色谱法原理：将氨基酸衍生化成为易于气化的物质，将其衍生物在一定温度下转化为气体，利用试样中各组分在气相和固定液液相间的分配系数不同进行检测分析6。应用较广的反应有两种，即生成三氟乙酰(N-TFA)氨基酸正丁酯和生成七氟丁酰基(N-HFA)氨基酸丁基酯。气相色谱具有高效能、选择性好、灵敏度高、操作简单的特点，还便于与质谱联用，确定氨基酸的结构，从而有可能发现新的氨基酸或测定非蛋白氨基酸。近年来，已在生化、医药、食品等方面得到了广泛的应用。缺点：气谱法必须衍生，而衍生中又要恪守严格的条件，不能用一根色谱柱实现全氨基酸测定，样品要经过脱盐处理，操作繁琐且易带来污染。1.3.3. 5 液相色谱法原理：由于样品溶液中的各组分在流动相和固定相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附解吸的分配过程进行分离检测。由于大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特征，为提高分析检测灵敏度和分离选择特性，通常将氨基酸进行衍生化。目前，氨基酸的液相色谱分析方法主要有柱后衍生法和柱前衍生法7,8。1.3.3.6 毛细管电泳色谱法原理：以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组成之间淌度和分配行上的差异而实现分离的技术。芳香族氨基酸可采用紫外检测直接测定，其他氨基酸在可见光和近紫外区域都没有光吸收，也不发射荧光，因此往往通过柱前或柱后衍生的方法进行紫外可见吸收或荧光检测10,11。衍生方式液相色谱一样，有柱前、柱后之分。商品仪器通常用柱前衍生，但对一些不够稳定的衍生试剂如OPA，应采用柱后衍生方式。氨基酸的对映体分离有两种方法：直接法和间接法。直接法是由两个对映体与手性选择剂形成不对称的络合物分子或其他结构，产生不同的物理化学性质从而达到分离的目的。间接法是先将对映体与手性选择剂反应生成非对映体化合物，使之产生物理和化学性质的差异，再通过电泳系统进行分离毛细管电泳具有进样少、绝对灵敏度高、分辨率高、溶剂消耗量少等优点，得到了迅速的发展。但是CE仍要继续提高分辨率、速度和检测器的选择性。同时，增加自动进样装置和使之微机化、商品化。1.3.3.7 电化学法原理：是建立在物质在溶液中的电化学性质基础上的一类仪器分析方法，采用适用于不同氨基酸的选择电极，对各种氨基酸进行测定12，氨基酸的电化学分析可分为直接电化学分析和间接电化学分析。对于胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等电活性的氨基酸一般采用直接电分法。多数氨基酸于金属电极上是非电活性的，无法直接测定，一般是采用衍生化反应将其转化成电活性的物质进行间接测定。氨基酸的电化学分析特点：此法以其简单、灵敏、无放射、无污染与各种现代化的分离方法相结合可以大大简化操作过程，节约分析时间。氨基酸的电分析法也存在不足，如具有直接电化学活性的氨基酸不多、可逆性较差、背景干扰较大、非电化学活性的氨基酸仍需进行衍生化反应等，因此，实际应用时选择合适的体系及反应方法。综上所述，实验测定氨基酸的方法有很多，通过比较，联系实际，我们选择了分光光度法进行测定。2 材料与方法2.1 实验原理本实验主要利用蛋白质物质经水解成氨基酸，而氨基酸在一定的pH条件下，与茚三酮反应生成蓝紫色化合物，对其进行比色定量测定，从而计算出相应的氨基酸含量。该化合物最大吸收峰在568nm波长处，且此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨基成正比，因此可作为氨基酸定量分析方法。52.2 实验试剂及仪器2.2.1 主要试剂 颜寇爽肤水广州品智化妆品有限公司诗莱雅爽肤水奥雪国际有限公司硝酸GR广州化学试剂厂活性炭CP广州增城连胜活性炭厂磷酸二氢钾AR广州化学试剂厂磷酸氢二钠AR广州化学试剂厂丙氨酸AR惠兴生化试剂有限公司茚三酮AR上海伯奥生物科技有限公司双氧水AR广州化学试剂厂2.2.2 主要仪器 T6新锐分光光度计，北京普析通用仪器公司；50、100ml容量瓶；1、2、5、10ml移液管；SYC-15超级恒温水浴，上海豫康科教仪器有限公司；25ml比色管；AL204-IC分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；EL20K标准型pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；烧杯，量筒等。2.3 溶液的配制2.3.1 磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾0.4535g，溶于水中后定容至50ml。2.3.2 磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠1.2938g，溶于水中后定容至50ml。取5.0ml磷酸二氢钾溶液于100mL容量瓶中，用磷酸氢二钠溶液稀释至刻度，摇匀。2.3.3 氨基酸标准溶液(200ug/ml)：准确称取丙氨酸(含量不小于98%)0. 2000g，用水溶解并定容至100mL, 摇匀后再吸取l0ml于l00ml容量瓶中加水稀释至刻度。2.3.4 2%茚三酮溶液：称取茚三酮1.0g，溶于一定量热水中，待冷却后定容至50ml。该溶液每隔(2-3)天需重新配制。2.4 实验方法2.4.1 测量波长的选择 取丙氨酸对照品溶液l ml于3个25ml比色管瓶中，加茚三酮溶液l ml和磷酸盐缓冲液1 ml，摇匀，水浴加热30min，取出，冷却，用蒸馏水定容至25ml。用可见分光光度计进行全波长测定。42.4.2 显色时间的考察 取2ml丙氨酸对照液于25ml比色管中，按“2.4.1”项显色方法进行显色后，以每5min间隔测一次吸光度A，绘制吸光值与时间的关系曲线4。2.4.3 标准曲线的绘制准确移取氨基酸标准溶液0.0，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mL(相当于氨基酸0,120，160,200,240,280ug)分别里于25mL比色管中，加水补充至4mL，然后各加人2%茚三酮溶液和磷酸盐缓冲溶液各1mL，摇匀。置沸水浴中加热，取出冷却至室温，加水至刻度，摇匀。静置15min，测吸光值，绘制标准曲线。42.4.4 样品氨基酸的提取2.4.4.1 称取样品1.0g置于烧杯中，加入10mL蒸馏水和g左右的活性炭，加热煮沸，10min后过滤，用68mL热水洗涤后过滤，收集滤液于25ml比色管中，定容至刻度，摇匀备用2。2.4.4.2 称取约1.0g样品于25mL比色管中，加硝酸5.0ml，双氧水1.0mL，放置30min后，于沸水浴中加热24h。加氢氧化钠调节p值为7左右，冷却至室温用蒸馏水定容至刻度。2.4.5 样品中氨基酸含量测定准确吸取澄清的样品溶液4mL，重复3次，按照2.4.3中测定步骤，在相同条件下测得吸光度值。3 结果与讨论3.1 测量波长的选择 可见分光光度计全波长扫描如图3-1，得最大吸收波长为568nm。图3-1 最大吸收波长曲线图3.2 显色时间的考察 吸光值与时间的关系曲线如图3-2，得最佳显色时间为30min。 图3-2 显色时间曲线图3.3 标准曲线的绘制用分光光度计在568nm波长下以0号作参比，用lcm比色皿测定试液的吸光度，绘制吸光度对氨基酸含量(ug/mL)的标准曲线（如图3-3），回归方程为，Y = 0.0014X0.1021，r = 0.9988。表明丙氨酸在120300ugmL范围内成良好的线性19。图3-3 氨基酸标准曲线3.4 样品氨基酸含量的测定样品氨基酸含量吸光值见表3-1，3-2。表3-1 颜寇爽肤水中的氨基酸含量颜寇爽肤水2.4.4.1提取方法2.4.4.2提取方法123123吸光值0.0650.0680.0620.0370.0360.034含量（ug/ml）528.86537.43520.29448.86446.00440.26平均含量（ug/ml）528.86445.04百分含量0.0530.043表3-2 诗莱雅爽肤水中的氨基酸含量诗莱雅爽肤水2.4.4.1提取方法2.4.4.2提取方法123123吸光值0.0840.0870.0850.0740.0780.076含量（ug/ml）58314591.7158600554.57566.00560.29平均含量（ug/ml）586.95560.29百分含量0.0580.055从表格可以得出，用不同的处理方法处理样品，氨基酸的含量会有所不同，用2.4.4.1提取氨基酸的含量相对的多。不同的化妆品中氨基酸的含量也有所不同，茚三酮比色法测定化妆品中游离氨基酸的含量，只是定量测定样品中所含的游离氨基酸，并不能说明所含此化妆品的质量好坏，若需要判定是否保湿，还需要进行大一致范围，化妆品中具有保湿作用的还有其方面。对皮肤来说，氨基酸具有缓和外界物质伤害的基本功效，适当的氨基酸，对受损角质有协助修复的效果，所以广泛被化妆品界所使用。3.5 注意事项3.5.1 茚三酮每隔23天需重新配置，尽量在使用时当天配制，茚三酮与氨基酸显色反应需在PH78之间，在实验中需检测磷酸盐缓冲溶液PH值。53.5.2 消化剂种类及其用量对消化结果的有影响，在化妆品前处理需考虑消化时间及温度对消化的影响。3.5.3 注意双氧水与化妆品强氧化性，会发生爆炸的危险性。总结随着国家不断加大对化妆品生产企业的监控力度认证推行，含氨基酸类食品生产厂家,必须加强对产品质量的检测，尤其在对生产过程的质量监控尤为重要，因此对检测方法更需要简便、灵敏、快速、重现性良好、抗干扰性强。14我们研究探讨了采用分光光度法对富含氨基酸类成分的制品中氨基酸的含量测定方法。实验证明，采用分光光度法检测含氨基酸类制品的检验方法是可行的。该法精密度高，抗扰性强。此项技术在目前食品、化妆品监管中具有十分普遍的意义。由于方法简单易行，几乎可以在一般的实验室使用。 致 谢 本论文是在侯勇老师的精心指导下完成的。做论文的这个月时间是我大学生活最充实和最快乐的一段时间，做实验一步步的摸索，从失败中找到原因并改进，让我充分感受到科学研究的魅力。论文结束之际，要衷心感谢侯勇老师在学业上的指导和生活上的关怀。感谢本实验侯勇老师、何素军、徐秋萍、吴影珊同学以及陈佩珊同学对本实验的帮助和指导。感谢中山职业技术各位领导和老师。最后，感谢我的家人、朋友一直以来在我的背后默默支持与鼓励，使得我能更加顺利地完成学业。卢金霞 2010年12月1日 参考文献1王朝晖, 蔡继文。我国化妆品质量检验面临的现状与对策。北京：科学出版社，2009, 6（33）：38-39。2 张驰，刘信平，周大寨。豆腐柴蛋白质及氨基酸含量测定。湖北民族学院学报(自然科学版)，2003，1（21）：68-70。3 黄红兵，朱品业。青天葵的薄层色谱鉴