王镜岩生物化学氨基酸与蛋白质ppt课件.ppt

第六节结构域 三级结构与球状蛋白质 在二级结构及超二级结构的基础上 多肽链进一步卷曲折叠 组装成几个相对独立的 近似球形的三维实体 一 结构域domain motif 模块 结构域是球状蛋白的折叠单位较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的 结构域一般有 氨基酸残基 结构域之间常常有一段柔性的肽段相连 形成所谓的铰链区 使结构域之间可以发生相对移动 结构域承担一定的生物学功能 几个结构域协同作用 可体现出蛋白质的总体功能 例 脱氢酶类的多肽主链有两个结构域 一个为NAD 结合结构域 一个是起催化作用的结构域 两者组合成脱氢酶的脱氢功能区 结构域间的裂缝 常是酶的活性部位 也是反应物的出入口 EF手 钙结合蛋白中 含有Helix Loop Lelix结构 锌指 DNA结合蛋白中 2个His 2个Cys结合一个Zn 亮氨酸拉链 DNA结合蛋白中 由亮氨酸倒链形成的拉链式结构 二 三级结构 整个多肽链在二级结构 超二级结构和结构域的基础上盘旋 折叠 形成的特定的整个空间结构 三级结构是多肽链中所有原子的空间排布 大的球形蛋白 200氨基酸以上 常常含有几个结构域 1 三级结构的特点 许多在一级结构上相差很远的氨基酸碱基在三级结构上相距很近 球形蛋白的三级结构很密实 大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出 这使得极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能 主要是二硫键 二硫键不指导多肽链的折叠 三级结构形成后 二硫键可稳定此构象 2 维持三级结构的作用力 氢键 范德华力 分子间及基团间作用力 定向效应 极性基团间诱导效应 极性与非极性基团间分散效应 非极性基团间 疏水相互作用 离子键 盐键 共价健 5 表面常常有空穴 配体结合部位 活性中心 三 球状蛋白质三维结构特征 1 含有丰富的二级结构元件 2 具有明显的折叠层次 3 分子呈现球状或椭球状 4 疏水侧链埋藏在分子内部 亲水侧链暴露在外表 第七节亚基缔合与四级结构 有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的等同结构成分组成 这种等同的结构成分称为原体 如血红蛋白 2 2就是由两个原体 组成 有时也把原体称为单体 一 有关四级结构的一些概念 1 亚基与单体 2 单体蛋白质 3 原体 protomer 四级结构的蛋白质中每一个球状蛋白质称为亚基 或单体 亚基一般由一条多肽链组成 只有一个亚基的蛋白质称为单体蛋白质 二 四级结构缔合的驱动力 疏水作用 极性基团之间的氢键和离子键 二硫桥 1 降低比表面积 增加蛋白质的稳定性2 丰富蛋白质的结构 以行使更复杂的功能 3 提高基因编码的效率和经济性 4 使酶的催化基团汇集 提高催化效率 5 形成一定的几何形状 如细菌鞭毛 6 适当降低溶液渗透压 7 具协同效应和别构效应 实现对酶活性的调节 四 四级缔合在结构和功能上的优越性 别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象 从而对活性部位产生的影响 五 寡聚蛋白与别构效应 别构蛋白 除了有活性部位 结合底物 外 还有别构部位 结合调节物 有时活性部位和别构部位分属不同的亚基 活性亚基和调节亚基 活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用 别构效应 就是别构效应 别构部位与效应物的结合对活性部位的影响 同促效应 同位效应 一种配体的结合对于其它部位结合后续同种配体能力的影响 包括 正 协同效应和负协同效应 同位效应一般是指活性部位之间的效应 同位效应是别构效应的基础 别构效应可以看成是对同位效应的一种修饰 异促效应 异位效应 正协同效性 一种配基的结合促进后续配基的结合 S型配体结合曲线 负协同效性 一种配基的结合抑制促进后续配基的结合 正效应物 促进活性部位与配基结合的别构效应物 负效应物 抑制活性部位与配基结合的别构效应物 第七节蛋白质结构与功能的关系 一 同功能蛋白质中氨基酸的种属差异 二 进化过程中同功能蛋白质在结构上的变化 三 蛋白质结构变化引起功能变化 四 一级结构的局部断裂与蛋白质的激活 一 同功能蛋白质中氨基酸的种属差异 比较生化 相关研究表明 不同来源的同功能蛋白质的化学结构基本相同 氨基酸种类和顺序也基本相同 只有少数几个氨基酸有相互差异 这些差异不影响功能 仅表现其种属的不同 如不同生物来源的胰岛素 同工 同源 蛋白质 是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质 如血红蛋白 不同种属来源的胰岛素中AA顺序的部分差异 二 进化过程中同功能蛋白质在结构上的变化 一级结构的种属差异与分子进化 在生物进化过程中同功能蛋白质的结构随生物进化也在不断进化 二 进化过程中同功能蛋白质在结构上的变化 同源蛋白质是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质 如血红蛋白 同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有的种属是相同的 称不变残基 invariantresidue 而其它位置的氨基酸对不同的种属有相当大的变化 称可变残基 variableresidue 同源蛋白质的氨基酸顺序中这样的相似性称为顺序同源 sequencehomology 不同种属来源的细胞色素c cytochromec 中 可以变换的氨基酸残基数目与这些种属在系统发生上的位置有密切关系 即在进化位置上相距愈远 则氨基酸顺序之间的差别愈大 不同生物细胞色素C的氨基酸差异 从表中可以看出 亲缘关系越近的物种 其细胞色素C的结构差异越小 亲缘关系越远 结构差异越大 所以可以通过细胞色素C的结构分析来核对生物进化的分类关系 以及各个物种在进化过程中的分歧时间 三 蛋白质结构变化引起功能变化 蛋白质有什么样的结构 就有相应的功能 如果结构发生了变化会引起相应的功能变化 这方面最突出的例子是分子病 1 一级结构的变异与分子病 在蛋白质的一级结构中 参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基 即使在整个分子中发生一个残基的异常 该蛋白质的功能也会受到明显的影响 被称之为 分子病 的镰刀状红细胞性贫血仅仅是574个氨基酸残基中 一个氨基酸残基改变所造成的 12345678正常 N 缬 组 亮 苏 脯 谷 谷 赖 贫血病 N 缬 组 亮 苏 脯 缬 谷 赖 镰刀形细胞贫血病 病人的红血球在缺氧时变成镰刀形 其病因在于细胞的血红蛋白的一条链上的第六位谷氨酸被缬氨酸取代 从而形成异常血红蛋白 由于病人的红血球形状异常 故不能输送氧气 造成病人在幼年时即致死 血红蛋白 亚基N端的第6号氨基酸残基发生了变异 它变异来源于基因上遗传信息的突变 2 变构蛋白 能通过构象变化来改变生物 生理 特性 活性 的蛋白质 变构酶 分子构象变化 活性变化 生化反应变化 3 蛋白变性与复性 a 变性 理化因素引起的蛋白空间结构解体及活性丧失 可逆 不可逆 b 复性 引起蛋白空间结构解体的理化因素消失 蛋白结构 活性恢复 四 一级结构的局部断裂与蛋白质的激活 在动物体内的某些生化过程中 蛋白质分子的部分肽链必须先按特定的方式断裂 然后才呈现出活性 血液凝固的生化机理酶原的激活 蛋白质的这一特性是在生物进化过程中发展起来的 具有重要的生物学意义 第八节个别蛋白质的结构与功能 8段直的 螺旋组成 分别命名为A B C H 拐弯处是由1 8个氨基酸组成的松散肽段 无规卷曲 4个Pro残基各自处在一个拐弯处 另外4个是Ser Thr Asn Ile 血红素辅基 扁平状 结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内 一 肌红蛋白的结构与功能 1 肌红蛋白的三级结构 肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质 由一条多肽链 珠蛋白 和一个血红素辅基组成 球状分子 单结构域 p255 2 肌红蛋白的氧合曲线 二血红蛋白的结构与功能 在血液中结合并转运O2 接近于球体 4个亚基分别在四面体的四个角上 每个亚基上有一个血红素辅基 链的三级结构与肌红蛋白的很相似 1 血红蛋白的结构 成人 HbA 2 298 HbA2 2 22 胎儿 HbF 2 2早期胚胎 2 2 2 血红蛋白的氧合曲线 四个亚基之间具有正协同效应 因此 它的氧合曲线是S型曲线 肌红蛋白和血红蛋白的氧合曲线的比较 增加CO2的浓度 降低pH能显著提高血红蛋白亚基间的协同效应 降低血红蛋白对O2的亲和力 促进O2的释放 反之 高浓度的O2也能促使血红蛋白释放H 和CO2 3 波耳效应及其生理意义 血红蛋白上有CO2和BPG结合部位 因此 血红蛋白还能运输CO2 波耳效应 BPG是血红蛋白的负效应物 BPG 2 3 二磷酸甘油酸 通过与它的两个 亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象 因而降低脱氧血红蛋白的氧亲和力 BPG进一步提高了血红蛋白的输氧效率 在肺部 PO2超过100torr 因此 即使没有BPG 血红蛋白也能被饱和 在组织中 PO2低 BPG降低血红蛋白的氧亲和力 加大血红蛋白的卸氧量 1 高山适应和肺气肿的生理补偿变化 BPG升高 2 血库储血时加入肌苷可BPG 4 BPG的别构效应 BPG2 3 二磷酸甘油酸 协同效应 波耳效应 别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率 三 免疫球蛋白的结构与功能 1 抗原与抗体 抗原 抗原是指进入异体机体后 能致敏淋巴细胞产生特异抗体 并能与抗体发生特异结合的物质 主要有蛋白质 核酸及其它高分子化合物 抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定 一级结构或空间结构 这种决定或控制抗原性的化学基团 抗原性 包括免疫原性和抗原特异性 免疫原性 是指诱导特异免疫反应的能力 抗原特异性 是指与抗体特异结合的能力 抗原决定簇 抗原决定簇的作用 被免疫活性细胞识别 从而激活免疫活性细胞产生抗体 与相应抗体的Fab结合 抗体 是在对抗原刺激的免疫应答中 B淋巴细胞产生的一类糖蛋白 它是能与相应抗原特异性结合 产生免疫反应的球蛋白 也称免疫球蛋白 抗体的特点 高度特异性 多样性 几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体 人体内任一时刻约有10 000种抗体存在 抗原抗体反应的条件 抗原决定簇与抗体结合部位构象互补 二者各有对应的化学基团 通过作用力使二者结合 离子键 氢键等 2 抗原抗体反应 抗体是2价的 抗原是多价的 抗体极度过剩 抗原分子所有价被抗体的饱和 可溶 抗原一抗体比例适中 形成网状的抗原 抗体复合物 不可溶 抗原极度过剩 抗体被饱和 可溶 基于抗体 抗原相互作用的生化分析方法 酶联免疫吸附测定 ELASA Western印迹 Westernblot 第九节蛋白质的分离 纯化和表征 一 蛋白质的酸碱性质和等电点 等电点 对于某一种蛋白质来说 在某一pH 它所带的正电荷与负电荷恰好相等 即净电荷为零 这一pH称为蛋白质的等电点 等离子点 中性盐 Ca2 Mg2 Cl HPO42 影响滴定曲线形状和等电点 盐离子浓度为0时的等电点称等离子点 等电点测定方法 溶解度法 聚焦电泳法 化学组成法测定最低分子量 SDS PAGE法 凝胶过滤法 渗透压法 扩散系数法 沉降系数法和沉降平衡法 二 蛋白质的大小与形状 测分子量的方法 1 根据分子组成测定最小分子量 例 如肌红蛋白含0 335 的铁 最低相对分子量 Fe分子量 Fe 100 55 8 0 335 16 700 2 葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量 3 根据渗透压测蛋白质的分子量 用一半透膜将蛋白溶液与纯水隔开 当渗透达平衡时 测定其渗透压 计算分子量 C 浓度 克 升 R 气体常数 0 082升 大气压 克分子 K开氏温度 T 绝对温度 开氏温度 以大气压表示的渗透压 4 用SDS PAGE测定蛋白质的分子量 SDS PAGE即十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 质点大小在1 100nm 可以进行布朗运动 三 蛋白质的胶体性质与选择性沉淀 蛋白质分子直径在1 100nm之间 在水溶液中具有胶体溶液的通性 布朗运动 丁达耳现象 不能通过半透膜 1 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 蛋白质表面极性基团形成的水化膜 非等电状态时 同种电荷的互相排斥 2 选择性沉淀蛋白质的方法 盐析法 大量的中性盐 NH4 2SO4 Na2SO4 Nacl 使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀 有机溶剂沉淀法 破坏水化膜 降低介电常数 PEG 丙酮 乙醇等 重金属盐沉淀 pH pI时带负电荷 与重金属离子 Hg2 Pb2 Cu2 等 结成不溶性沉淀 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 pH小于等电时 蛋白质带正电荷 易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀 生物碱试剂 单宁酸 苦味酸 钨酸 酸类 三氯乙酸 磺基水杨酸 加热变性沉淀 等电点沉淀法 指因某些物理 化学因素的影响 使蛋白质的生物学活性丧失 四 蛋白质的变性 强酸和强碱 有机溶剂 破坏疏水作用 去污剂 去污剂都是两亲分子 破坏疏水作用 还原性试剂 尿素 硫基乙醇 盐浓度 盐析 盐溶 重金属离子 Hg2 pb2 能与 SH或带电基团反应 温度 机械力 如搅拌和研磨中的气泡 1 变性的因素 制备活性蛋白质时严防蛋白质变性 2 蛋白质变性后出现的现象 生物活性丧失 硫水基团外露 分子结构伸展松散 易被蛋白酶水解 溶解度降低 沉淀 粘度增加 3 蛋白质变性的实质 次级键 有时包括二硫键 被破坏 天然构象解体 但变性不涉及一级结构的破坏 不可逆变性 蛋白质变性 可逆变性 前处理粗分级细分级浓缩保存 五 蛋白质分离纯化的一般原则 纯化的实质 增加制品 preparation 的纯度或比活性 纯化的一般程序 电泳 前处理 粗分离 细分离 生物组织 无细胞提取液 破碎 溶解 差速离心 选择性沉淀法 亲和层析 离子交换层析 精制后的蛋白质 凝胶过滤 疏水层析 吸附层析 1 前处理 将组织和细胞破碎 超声波震荡 与砂研磨高压挤压 溶菌酶处理 分解肽聚糖 动物组织和细胞 电动捣碎机 waringblender 匀浆器 homogenizer 超声波处理 ultrasonication 植物组织和细胞 石英砂 提取液 研磨纤维素酶处理 微生物细胞 差速离心法收集细胞的某一组分 如果提取膜蛋白 超声波或去污剂使膜解聚 然后用适当的介质提取 NH4 2SO4分级沉淀法 盐析 等电点选择性沉淀法 有机溶剂分级沉淀法 热处理选择性沉淀法 生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法 2 粗分级 roughfractionation 一般用选择性沉淀法 3 细分级 finefractionation 首先采用透析或sephdexG 25凝胶过滤除盐 层析法 凝胶过滤层析 离子交换层析 吸附层析 亲和层析 疏水层析 反相HPLC 电泳法 自由界面电泳 区带电泳 凝胶电泳 滤纸和薄膜电泳 粉末电泳 细丝电泳等 盘状电泳 等电聚焦 双向电泳等 密度梯度离心 4 保存 晶体保存 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯 能否结晶不仅是纯度的一个指标 也是判断制品是否有活性的指标 纯度越高 溶液越浓 越容易结晶 结晶方法 使溶液略处于过饱和状态 降低温度 盐析 加有机溶剂 调节pH 接入晶种 冻干粉保存 溶液保存 加入抗冻剂 50 甘油 后 20至 70 保存 根据蛋白质的溶解度分离 根据电荷差异分离 根据分子大小分离 根据配体特性异性分离 亲和层析 选择性吸附分离 物理吸附 根据疏水性的差异 六 分离纯化蛋白质的主要方法 盐析法PEG沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法重金属盐选择性沉淀法 pH pI 蛋白质带负电荷 生物碱和酸选择性沉淀法 pH pI 蛋白质带正电荷 热处理沉淀法 铜锌SOD 65 15分钟 稳定 1 根据溶解度差异的分离 选择性沉淀法 在pI时 分子电荷为零 蛋白质分子间的静电排斥消失 从而蛋白质出现聚集沉淀 等电点沉淀 在等电点条件下 蛋白质的电导性 溶解度最小 粘度最大 蛋白质的盐溶与盐析 盐溶 低盐浓度时 蛋白质溶解度 称盐溶 盐析 高盐浓度时 使蛋白质溶解度 析出 称盐析 盐析多用溶解度大的中性盐 如 NH4 2SO4 NaCl MgCl2 NH4Cl KCl等的饱和溶液 2 根据分子大小和形状的差异 透析 超滤 密度梯度离心 凝胶过滤法 交联葡聚糖 Sephadex 聚丙烯酰胺凝胶 Bio GelP 琼脂糖凝胶 Sepharose Bio GelA 交联葡聚糖 Sephadex 的分子结构 从电泳结果分 自由界面电泳 区带电泳 盘状电泳从装置上分 圆盘电泳 柱状 水平板电泳 垂直板电泳 从支持物分 自由界面电泳 纸电泳 或薄膜电泳 凝胶电泳 PAGE 琼脂糖胶 淀粉胶等 3 根据电荷性质的差异 电泳和等电聚焦 普通电泳 等电聚焦 双向电泳 脉冲电泳 毛细管电泳 等电聚焦电泳法测定蛋白质pI 2Dgelinproteomics 离子交换纤维素 离子交换交联葡聚糖 离子交换交联琼脂糖 离子交换层析法 交联葡聚糖离子交换剂 4 根据选择性吸附的差异 吸附层析法 极性吸附材料 硅胶 氧化铝 岩藻土 离子吸引和氢键 非极性 活性炭 范德华力 疏水作用 结晶磷酸钙 Ca10