肿瘤部位光敏剂浓度检测

,肿瘤部位光敏剂浓度检测,新技术讲座,一 课题背景及研究目的和意义二 国内外研究状况及分析三 研究思路及方法四实验中发现的问题,光动力学疗法（PDT）具有组织选择性好、对微血管组织的损伤作用强、全身副反应少等特点1,2。PDT治疗：将某种外源性光敏物质注射入生物组织中，在激励光源照射下，光敏物质吸收光子能量后，由基态变成激发态，之后又退激发并返回基态的过程中生成大量活性氧物质 (ROS)，其中最主要的是单线态氧(1O2)，1O2是一种光毒性物质，能与多种生物大分子相互作用，损伤细胞结构或影响细胞功能，从而对病变组织产生治疗作用。光动力学疗法有望克服传统诊疗方法的缺点和不足，为癌症的治疗提供了新的途径和可能，由此可见，对其诊疗癌症的研究是非常必要的3。在临床上有一定的治疗效果，但治疗剂量受到光敏剂浓度的影响，所以在治疗前需要对光敏剂浓度给予定量检测。,课题背景,4,研究目的和意义,经过归纳分析提出：激光、氧和光敏剂是影响光动力学疗法的生物学效应的三要素4,5，它们之间的量效关系相当复杂6，治疗过程中靶组织内光敏剂的含量是影响光动力反应效果的重要因素7。不同的患者药代动力学同，所以在PDT治疗前需要实际测量每一位患者肿瘤部位光敏剂含量8-11。考虑到，非接触式荧光光谱测量载体光敏剂浓度12区别传统的接触式的、耗时长的、破坏性的测量方式13，对载体动物实验以至于临床诊断及治疗有着非常重要的作用。载体测量光敏荧光光谱信号会受到测量的肿瘤的形状、生物组织的吸收和散射等影响14,15，导致测得的荧光强度不能精确地反应光敏剂浓度。目前在光动力临床治疗中，光敏剂荧光诊断还处于离体测量的阶段，不能准确的获得临床载体光敏剂定量测量，无法确定每一患者在注入光敏剂后某些时间段的光敏剂浓度是否达到光动力治疗标准，从而限制了光动力治疗疾病的使用。,荧光光谱方法测量肿瘤细胞光敏剂含量国外研究状况,1996年以前，光敏剂荧光诊断光敏剂浓度的方法被广泛的研究16-19，但所有载体辐射荧光检测不仅受到光敏剂浓度的影响还受到测量肿瘤部位的几何形状、生物组织对激励波长与辐射波长吸收与散射的影响16-19。当获得生物组织的吸收、散射等光学特性参量时，被改变的荧光光谱轮廓可能被修正，由荧光团所确定的光敏剂浓度的准确度可以达到15%20。实验与蒙特卡洛仿真同时证明了通过减少测量样品的直径约100um或更少来降低生物组织的散射和吸收的影响，使得荧光强度与英光团浓度呈线性关系21，22。1997年，R. A. Weersink研究小组提出了另一种方法23，即反射光谱的漫反射近似可以用于确定光敏剂的浓度，生物组织反射光可以通过带有多个激励源与探测分离的面探头来测量，这里散射与吸收系数都可以通过漫反射来推算。在皮肤表面及新西兰白鼠身上，这种方法被用来研究光敏剂浓度。对于内脏器官的实际与测量的光敏剂浓度都一致，但在皮肤组织上实际值与测量值相比低了3倍，并且光纤头太大以至于不适用于内窥镜通道的适用。,图1 后向散射光测量方法光纤结构示意图，其中一根为激励光纤其他为探测光纤,图2 在442nm激励下探测的荧光强度与后向散射强度的比值随光敏剂吸收吸收的变化情况,1997年，Judith R. Mourant研究小组发现采用分离式激励与接收方式（间距约为1.7mm）反射光谱与吸收系数之间的线性关系，通过测量生物组织的弹性散射谱来计算组织内相关复合物的浓度23。在1999年该方法被用于组织内光敏剂药物浓度的检测24。2000年，该研究小组采用分光手段提出一个无创的实时光敏剂治疗药物浓度检测方法，如图1所示。该方法通过稳态的荧光光谱仪对荧光的后向散射进行测量，发现荧光强度与激励光后向散射光强度的比值与光敏剂吸收系数存在线性关系，如图2所示。,2000年，Brian W. Pogue26研究小组采用了一个实验方案如图3所示，证明了微小采样方法（选用间隔700um多路直径为100um的光纤）可以增加探测返回荧光信号的强度，减小生物组织对光敏剂荧光的影响。,图3 左图为光纤测试系统示意图，右图为微小采样的多路光纤束浸入生物组织的示意图，注本图没有显示出所有的光纤个数，实验中采用37路光纤束。,图4 在注入AIS2Pc光敏剂后测得的荧光强度随化学萃取法测量的浸入浓度变化情况，左图为动物内脏右图为肌肉组织在同一个人的测量结果，两图给出的斜率相似表明生物住在的类型对本探测响应几乎无关。,该研究小组进行了小鼠肝脏与肌肉组织下注射光敏剂的活体实验，验证了不同组织的光敏荧光信号强度随光敏剂（ALS2Pc）浸入浓度（通过对组织提取测量的结果）的响应斜率较为相近11%，如图4所示。表明探测器响应几乎不受到生物组织的影响，所以该实验方法可以减少生物组织荧光噪声对光敏剂荧光的影响。,2007年， Wilson BC研究小组探索了新的光动力计量方法，提出通过特定的单线态氧荧光探测与基于光敏剂漂白计量方式相结合的全光的计量方法27，如图5所示。,图 5 单线态氧光谱强度与光敏剂荧光探测系统的示意图。,荧光光谱方法测量肿瘤细胞光敏剂含量国内研究状况,1. 目前国内在光敏剂浓度方面的研究主要有解放军总医院顾英教授与北京理工大学于常青副教授进行研究，在2008年该研究小组对皮肤表面鲜红斑痣光动力治疗中皮肤光敏剂含量的光谱信息提取方面的研究28。该实验方案主要有半导体激光器作为光源、单路激励光纤与多路接收光纤探头、光纤光谱仪以及手提电脑的实验设备来完成如图6所示。在440nm的激发下对皮肤组织的荧光光谱及注射光敏剂（PSD007）后的荧光光谱给予测量，并观察了注射光敏剂几分钟后光谱的红移谱峰，如图7，8所示。,图 6 荧光光谱仪的各个组成部分,图 7 注射光敏剂后 PDT 治疗中 PWS 皮肤和正常皮肤的荧光光谱对照,图 8 照光前后 PSD007 白蛋白缓冲溶液的荧光光谱,图8显示出670nm 处又出现了一个荧光峰，这是光敏剂受光照射后产生光产物的特征峰皮肤荧光主要来自于皮肤自体荧光、光敏剂荧光和光产物荧光,认为 PWS 皮肤实测光谱在排除血红蛋白和黑色素的吸收后主要为三种基本荧光物质的荧光光谱的叠加：皮肤自体荧光（主要荧光物质来源是黄素腺嘌呤二核苷酸，简称FAD）、光敏剂荧光以及光产物荧光。,基于光谱在肿瘤组织部位的叠加原理,需要从各自的水溶液中提取FAD、光敏剂、光产物的特征光谱，并通过实际测量取得人体皮肤血红蛋白和黑色素的吸收谱。,由于PSD007 荧光特征峰、光产物荧光特征峰以及血红蛋白吸收峰较为对称且接近高斯形态，因而对其采用高斯拟合；而FAD的荧光峰以及黑色素吸收谱都不对称，采取多项式拟合方式。由于荧光光谱采集数据间隔很小，数据量很大，数据分布均匀，且互不相关，方程组求解采用一般的最小二乘回归即可,两个患者的临床测量结果与拟合结果的对比图,图9 临床实测光谱与拟合光谱对比结果,2. 在2008年，哈尔滨工业大学张治国教授课题组建立了用于牙结石的荧光比例方法29，并取得较高的灵敏度。离体的肿瘤细胞的光敏剂荧光与自体荧光密度谱线一定波长范围积分的比值与光敏剂浓度存在线性关系，荧光比例的公式为：,OP=(SB-SC)/SA,OP = SB/SA， =SC/SA,上式中 定义为自体荧光系数，对于同一物质 为一常数，通过计算得出不加光敏剂的Eca-109 细胞所对应的 为 0.145。该公式的图像表示形式如图10所示，其值与光敏剂浓度获得的线性关系如图11所示。,图 10 光敏剂浓度参量的原理图,SA是以 490 nm 的荧光峰为中心，两端为荧光强度衰减到初始的 1/e 处的荧光曲线下的面积，表征了细胞自体荧光的强度。SB是以 630 nm 的荧光峰为中心，两端为荧光强度衰减到初始的 1/e 处的荧光曲线下的面积。SC是不加光敏剂的 Eca-109 细胞在以 630 nm 的荧光峰为中心，两端为荧光强度衰减到初始的1/e 处的荧光曲线下的面积，(SBSC)表征了HMME 光敏剂的荧光强度。,图11 不同浓度 HMME 溶液 OP 值拟合曲线,三、研究思路及方法,1.理想定标：确定纯光敏剂不同浓度与激发光敏剂特征峰值荧光光谱相对强度线性关系。2.离体定标：a，确定浸入肿瘤细胞内光敏剂不同浓度与激发光敏剂特征峰值荧光光谱相对强度线性关系；b，确定浸入肿瘤细胞内光敏剂不同浓度与激发光敏剂荧光和自体荧光特征峰比值的线性关系。3.载体测量：对小鼠体表肿瘤在注入一定剂量光敏剂后，每间隔一定时间进行激发肿瘤获得其荧光光谱相对强度，并根据其强度值及已知的线性关系，推算此时肿瘤细胞内的光敏剂浓度值。4. 阈值浓度：可进行有意义的光动力治疗时最小的光敏剂浓度值。,实验方案设计,线性关系理论模型一 （这里给出理想检测时吸收激励光与激发荧光之间的关系，未考虑肿瘤细胞对激励光的散射、吸收、收集效率及肿瘤形状等因素）,（1）,（2）,线性关系物理模型二：单一波长激励下光敏剂荧光相对与自体荧光的相对强度与光敏剂浓度线性关系。,在 波长激发下的公式关系,（4）,（5）,（6-1）,（6-2）,考虑实际测量光谱值并非理论真实值，则定义如下关系式：,（7）,则（7）式可改写为：,（8）,上式中，N/R被认为待测荧光组织及返回激发光产生的背景噪声。,物理模型三：双波长激励下可消去噪声对线性关系的影响。,同理另一个波长 激励下,（9）,(8)式与(9)式相减：,（10）,令,则有,（11）,当待测肿瘤细胞浓度确定时， 为常量。,光谱分析实验研究,实验方案： 采用荧光质量分析仪对正常细胞、PSD007孵化肿瘤细胞、正常细胞荧光光谱进行检测。 正常细胞：大鼠的脾脏白细胞；肿瘤细胞:LG12实验内容： 确定细胞自体荧光、PSD007光敏剂荧光、ALA光敏剂荧光特征峰的位置，对激发光源波长进行指导。,PSD007吸收光谱测量结果,No.波长(nm) 吸收值1619.500.2752568.000.5603540.000.6294505.500.8525405.003.4566360.004.0397352.004.0398338.003.914,405nm激发下正常组织细胞荧光谱,400nm激发下肿瘤+PSD007光敏剂荧光谱,635nm激励下未发现荧光信号,细胞实验研究-理想定标离体细胞定标,实验方案：激发光源：405nm连续激光器、荧光质量分析仪待测样品：纯不同浓度PSD007、孵化白血病肿瘤细胞光线探头：平头多纤芯NA=0.22医用光纤光谱仪：USB400、tristan光纤光谱仪（300-1000nm） 实验内容：找到合适的光纤光谱仪积分时间。调节光纤探头位置，找到距离待测样品的合适位置。测量不同浓度下光敏剂荧光相对强度。激光激励与荧光质量分析仪两种方法下测量结果进行对比。,荧光质量分析仪获得不同浓度PSD007光敏剂测量结果,荧光特征峰614nm处相对强度与光敏剂浓度之间线性关系,浓度范围0.019ug/ml-5ug/ml,浓度范围0.019ug/ml-0.625ug/ml,理想定标线性关系曲线荧光质量分析仪,PSD007孵化白血病肿瘤细胞测量结果低浓度,405nm光源激发下不同孵化浓度肿瘤细胞光敏剂荧光强度,405nm光源激发下肿瘤细胞裂解后光敏剂荧光强度,裂解前激发肿瘤细胞获得光敏剂荧光强度（高浓度孵化）,裂解后激发纯光敏剂荧光强度（高浓度孵化）,PSD007孵化白血病肿瘤细胞测量结果高浓度,孵化浓度为（6.25ug/ml-100ug/ml）PSD007，浸入细胞内浓度与光敏剂荧光特征峰（616nm）强度的线性关系,孵化细胞后离体定标线性关系曲线荧光质量分析仪,光谱仪,405nm激光器,待测样品,光纤探头,高精度三维手动位移台,激光器连接头,光谱仪连接头,405nm激励下PSD007的荧光光谱信号,低浓度光敏剂与激发荧光特征峰值(614.9nm)的线性关系,405nm激发下的线性标定曲线LD光源,405nm激光激发下白血病肿瘤细胞荧光信号,裂解前细胞内光敏剂的荧光光谱信号,裂解后的荧光光谱信号,405nm激光激发裂解后提取PSD007荧光光谱,注：裂解前405nm激光激发肿瘤细胞未发现荧光信号,孵化浓度为（6.25ug/ml-50ug/ml）PSD007，浸入细胞内浓度与光敏剂荧光特征峰（613nm）强度的线性关系,两种实验条件下同样待测样品获得光敏剂孵化浓度推算结果如下表,生物组及其肿瘤实验研究,实验方案：激发光源：405nm连续激光器、荧光质量分析仪待测样品：PSD007浸入小鼠直肠及小鼠皮下植入肿瘤组织光线探头：平头多纤芯NA=0.22医用光纤光谱仪：USB400、tristan光纤光谱仪（300-1000nm） 实验内容：小鼠分别采用涂抹与静脉注射两种方式给药。405nm激光激发不同给药时间的光敏剂荧光特征峰强度变化情况。不同组织部位荧光强度变化情况。,1小时直肠局部给药不同部位光敏剂荧光光谱,2小时直肠局部给药不同部位光敏剂荧光光谱,小鼠直肠局部涂抹PSD007光谱测量结果,629nm荧光特征峰值随直肠局部涂抹给药（PSD007）时间变化情况,四、实验中发现的问题,由于生物组织噪声影响，光敏剂荧光峰值会发生偏移，无法采用理论峰值波长来计算光敏剂浓度，即荧光信号不稳定。当光敏剂浓度较弱时，荧光信号与杂散光的信噪比较低，对后期处理与分析带来很多问题。反回激发光强度过强，产生了饱和噪声严重影响荧光信号探测相对强度的准确性。光谱仪积分时间-照射剂量-距离-光敏剂浓度，三者的选择对于荧光信号探测有