浅谈儿童实体瘤中mdrl基因与p53基因的表达及关系.doc

浅谈摘要: 在儿童肿瘤的治疗中，化学治疗是主要手段之一，但肿瘤细胞的耐药性是影响其疗效的主要障碍。mdrl基因/pgp的过度表达与某些儿童实体瘤的耐药、较差的预后、化疗和病理分型相关，肿瘤细胞mdrl基因表达水平的检测，有较大的临床意义。p53突变率。体外培养和基因转染研究表明p53基因对mdrl启动子的调节作用，野生型p53能够抑制mdrl基因转录，减小pgp生成，而突变型p53能刺激mdrl启动子，增强mdrl基因的表达。而在小儿实体瘤中，p53基因可能对mdrl基因也有调控作用。 1mdrl基因与儿童实体肿瘤的多药耐药性 在儿童肿瘤的治疗中，化学治疗是主要手段之一，但肿瘤细胞的耐药性是影响其疗效的主要障碍。肿瘤耐药性的特点是，耐药性瘤细胞可以对一些在结构和功能上迥然不同的药物产生耐受，即所谓多药耐药（multidrug resistance,mdr）现象。肿瘤细胞耐药可分为内在性耐药和获得性耐药两类。目前，有近一半的儿童恶性实体瘤不能治愈，mdr是导致肿瘤化疗失败的重要原因。据美国癌症患者中，90%以上在不同程度上受到耐药的影响。近10年来，许多学者致力于肿瘤的多药耐药性研究，试图揭示mdr的本质和其作用机理，同时对mdr的逆转进行研究。 11 mdr表型与p-糖蛋白 1968年，kessel等首先在啮齿类动物的细胞中发现mdr现象。1976年，juliano 和ling的研究对秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢细胞（chinese hamster ovary ,cho）时，发现其胞膜中有一个分子量约170kda的糖蛋白与细胞膜的通透性有关，于是命名为p-糖蛋白（p-glycoprotein,pgp）。该蛋白的发现，首次解释了产生mdr的分子机制。 近来有关mdr细胞株研究结果揭示mdr细胞株常表现出复杂的多元化。表型归纳起来主要表现在：增强对多种细胞毒药物耐受；降低细胞内药物浓度；过度表达170-180kda膜糖蛋白（pgp）；增加药物的细胞外排能力；协同细胞膜活性因子感受性；耐药能力能被某些化学物质逆转。 与mdr有关的许多药物都是临床上常用的化疗剂，如阿霉素、长春新碱、长春花碱、vp-16、放线菌素d、丝裂霉素等。虽然mdr可由多种原因引起，如谷胱甘肽及相关酶的改变、拓扑异构酶?的改变、dna损伤修复能力增强、多药耐药相关蛋白表达增加、蛋白激酶c的变化。但多方面研究证实，多药耐药基因（multidrug resistance gene, mdrl）及其产物pgp的过度表达是其主要原因之一1。 12 mdrl基因的结构和功能 多药耐药基因mdrl定位于7号染色体的7q21.1。对mdrl基因的全长cdna序列分析表明，其编码蛋白有1280个氨基酸残基，分子量约140kda;经翻译后修饰再加上约30kda的糖链，即为分子量170kda左右的pgp。氨基酸序列对比发现，pgp属于atp结合盒超家族成员，p-糖蛋白属于一种依赖atp供能的转运蛋白，主要分布在细胞膜上。其功能涉及到转运细胞中，其生存环境间的多种物质，如肽类、内源性激素、异生物（包括各种天然及半合成化疗药物），在某些生理情况下，还可以作为氯离子通道，转运氯离子。 13 mdrl/pgp 在儿童肿瘤中的表达及作用 oda y2用rt-pcr、northern吸印转移法和免疫组化技术检测了36例儿童实体瘤，结果13例神经母细胞瘤中11例（47.8%），11例肾母细胞瘤中7例（63.3%），显示mdrl的pcr产物，northern吸印转移法分析显示，34例标本中11例（32.4%）检出mdrl基因，免疫组化结果显示36例标本中26例（72.2%）表达pgp，统计分析示免疫组化检测与rt-pcr检测结果呈显著性相关（p=0.0001）。re gg3通过免疫组化和mrna分析，21例肾母细胞瘤，结果普通型肾母细胞瘤mdrl和pgp表达全部阴性，3例间变肾母细胞瘤有1例显示m drl和pgp表达，同时体外细胞培养证实存在pgp表达和耐药性，研究者认为pgp表达与肾母细胞瘤的病理分型相关。volmm4用mrna分析、pcr和免疫组化方法，检测8例术前没有接受化疗肾母细胞瘤中的pgp的表达，结果全阴性，而术前接受化疗的23例肾母细胞瘤中，12（52.2%）例阳性，pgp总的阳性率为38.7%（12/31）。研究者认为pgp的表达与化疗有关。 serra-m5用免疫组化法检测105例原发和转移骨肉瘤，pgp表达率分别为23%和50%，认为pgp过度表达与高的复发率和较差的预后显著相关，支持pgp在抗药反应中的作用，还有报道一些小儿实体肿瘤如儿童肉瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤，均显示pgp表达与差的预后相关。 研究结果表明，肿瘤细胞mdrl基因表达水平的检测，有较大的临床意义：初治时mdrl基因表达的水平，能大致反映肿瘤对化疗是否敏感，初步预测化疗的效果；在有些肿瘤，如骨肉瘤、神经母细胞瘤、小儿软组织肉瘤、小儿髓母细胞瘤等，mdrl基因表达水平与患儿预后呈负相关，mdrl基因的表达可作为一项预后指标；对复发肿瘤患儿，mdrl基因表达水平升高是获得性mdr的标志，临床治疗中可能需更改化疗方案；mdrl的检测还可能作为选用化疗增敏剂的指标，在指导肿瘤治疗中发挥重要作用。 目前，比较清楚是蛋白激酶c可以在mdrl的蛋白水平发挥调节作用，前者通过对后者磷酸化或磷酸化，而影响后者功能的发挥。外源性异物、某些金属盐类等，均能诱导pgp的暂时高表达；某些癌基因也可能调节mdrl基因的表达。 14 pgp介导的多药耐药性的逆转研究 pgp发挥能量依赖型外排泵的作用对象无特异性。对化疗药物以外的许多非细胞毒性化合物，pgp也能将其从细胞内主动地转运到细胞外。因此，当胞膜上的pgp含量恒定时，化疗药物与此类非细胞毒性化合物 pgp结合就存在着竞争。提示如果增加其它化合物与pgp的结合就会减少其对化疗药物的外排，提高化疗药物的细胞内浓度，增强药物对肿瘤细胞的作用，这称为mdr的调节或逆转。此类化合物通称mdr调节剂、mdr逆转剂或化疗增敏剂，包括：钙离子通道阻滞剂（维拉帕米及其衍生物）、环孢菌素（环孢菌素a及其衍生物）、钙调蛋白抑制剂（三氟丙嗪等吩噻嗪类化合物）、抗疟药（如奎宁）等。目前，应用此类药物逆转肿瘤细胞的mdr表型。目前，应用此类药物逆转肿瘤细胞的mdr表型，增加化疗药物对肿瘤细胞的作用已开始进入临床试验。 miniero等6对一组20例儿童晚期肿瘤，进行了联合治疗，mdr逆转剂用维拉帕米和环孢菌素a，化疗用阿霉素和vp-16，结果5例患儿获得完全缓解。maia rc等7报告15例用vp-16治疗复发的白血病患儿，经vp-16和环孢菌素a联合治疗，其中2例pgp免疫组化染色阳性患儿对治疗有反应。 儿童恶性肿瘤的mdr表型及其逆转，值得进一步深入研究。尽管目前mdr逆转剂与化疗联合应用，治疗儿童恶性肿瘤尚处于临床试验阶段，但随着对mdr机制的深入了解，体外细胞mdr表型逆转试验的成功，和高效mdr逆转剂不断发现，并逐步用于临床，儿童恶性肿瘤支化疗药物的mdr将被克服，将儿童恶性肿瘤的治愈带来新的希望。 2 p53基因与儿童肿瘤 21 p53 基因的结构 p53基因是一种肿瘤抑制基因，位于17号染色体短臂17p13.1，其dna全长16kb20kb，由11个外显子和10个内含子组成，外显子2、4、5、7、8编码5个进化高度保守的mrna结构区，其蛋白质产物定位于细胞核，为一种含有393个氨基酸磷酸核蛋白，分子量约为53kda。 22 p53基因的生物学功能 p53基因作为转录因子，通过两个途径调节细胞生长和发育，一为调节dna复制启动复合物的组装和功能，对细胞进入s期进行调控；二为p53基因可能是某些抑制细胞增殖的基因的反式激活因子，从而对细胞分裂进行负调控。p53基因诱导调控其下游调节因子的转录，如waf1/cip1、mdm2、g add45等与细胞生长或抑制有关的基因，它们在上游区具有与p53结合位点共同的序列，受p53负调控，影响细胞生长或分化。 野生型p53基因作为分子警察（molecular policeman），监视细胞基因组的完整性。如果dna遭受紫外线辐射或癌症化疗药物损伤后，p53蛋白累积，dna得制停止，介导细胞停滞在g1期，并启动修复系统，予足够的时间进行dna修复。如果修复失败，则p53丧失了这种功能，基因组稳定性下降，突变和染色体重排以较高速率发生，导致恶性克隆的出现。p53基因不仅能通过增加肿瘤细胞凋亡来限制肿瘤的发展，还与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性有关。p53基因是化疗药物活化调亡路径上的中介，即化疗药物有效活化凋亡路径需要p53的参与。因此，含有野生型p53基因的肿瘤细胞对化疗敏感，含有突变型p53基因的肿瘤细胞，p53依赖的凋亡路径失活，对化疗药物产生耐药性，只有大剂量的化疗药物方可重新活化p53依赖的凋亡路径。 23 p53基因在儿童肿瘤中的表达及作用 在p53基因的11个外显子和10个内含子中，突变好发部位为外显子5-8，被称为突变热点，约相当于编码子132-281区域。目前研究表明很多肿瘤既有p53双等位基因的突变，又有单基因位点的突变并伴有野生型位点的丢失。故在不同的肿瘤中p53基因改变呈多种形式，即：错义突变；选择突变，多数集中在130-290号氨基酸上，尤其是4个高度保守区（130-142，171-180，234-260，270-287）；至少存在3个突变热点（175，248，273号氨基酸），不同组织类型突变热点的频度和分布并不相同。研究表明p53基因的突变是人类肿瘤中最常见的改变，大约50%人类肿瘤都有p53基因的突变。检测病人p53的突变可用于肿瘤的辅助诊断和预后的监测。 正常的p53蛋白在细胞中易水解，半衰期为20min左右，因而应用免疫组化方法不能检测到p53蛋白；而突变型p53蛋白半衰期为212h，同时，突变的p53基因产生的蛋白构型发生改变，蛋白稳定性增加，导致半衰期的延长，并在恶性肿瘤细胞核内堆积，因而可应用免疫组化方法检测出p53蛋白的异常表达，反映p53蛋白在核内的积累，如sv40大t抗原和eb1b均能和p53蛋白结合形成一寡聚体蛋白复合物，导致p53蛋白的稳定性增加。研究表明p53蛋白的异常表达与p53基因突变具有很好的相关性。 bardeesyn8pcr-sscp法检测了140例肾母细胞瘤中p53基因的突变，结果突变率为5.7%（8/140），其中11例间突变肾母细胞瘤中8例（72.7%）p53基因突变，认为p53基因是一个影响肾母细胞瘤生物学行为的重要抑癌基因，其突变涉及间变的发生，并可作为肾母细胞瘤间变的分子标记。bahtimi r等9通过免疫组化技术、northern吸印转移法，检测13例肾母细胞瘤的p53基因，结果3例（23.1%）阳性，10例普通型肾母细胞瘤均无p53基因突变，而3例间突变型肾母细胞瘤均有p53基因突变，认为在肾母细胞瘤间变过程中p53基因突变起重要作用。govender d等10用免疫组化法检测93例肾母细胞瘤中p53蛋白的表达，共有8例（8.6%）阳性，其中86例预后好的组织型3例阳性，7例预后差的组织型5例（71.4%）阳性，证实p53蛋白表达与组织类型和差的预后相关。lahoti c等11用免疫组化疗检测28例肾母细胞的p53，阳性率为64.3%（18/28），复发/转移组和非复发/非转移组分别为93.8%(15/16)和25.0（3/12），表明p53阳性表达与肾母细胞瘤的复发/转移正相关。 kusafuka t等12用pcr-sscp法和直接基因测序检测p53基因中5-8外显子的突变，82例儿童恶性实体瘤中，只有2例被检出p53基因突变，1例为横纹肌肉瘤，另一例为肝未分化肉瘤，认为儿童实瘤中p53突变是不常见的。但是karami-topoulou e等13用免疫组化检测137例原发性中枢神经系统肿瘤和17例髓母细胞瘤，结果前者p53蛋白表达率为33.5%，且p53表达与肿瘤组织分级相关，在17例髓母细胞瘤8例（47.1%）p53蛋白表达。近来研究表明，儿童恶性星形细胞瘤和儿童恶性胶质瘤p53免疫组化检测阳性率高达37.9%100%，且与差的预 后相关1416。 以上研究表明p53基因突变与某些小儿实体瘤的恶性程度、复发、转移和差的预后相关，可作为肿瘤的恶性指标之一。小儿神经系统肿瘤有较高的p53突变率。 3mdrl基因与p53基因的关系 chin kv等17，goldsmith me等18通过体外培养和基因转染，研究p53基因对mdrl启动子的调节作用，认为p53能调控pgp的表达，野生型p53能够抑制mdrl基因转录，减少pgp生成，而突变型p53能刺激mdrl启动子，增强mdrl基因的表达。linn sc等19用双标免疫组化染色检测50例乳腺癌病例中的p53和pgp表达，显示pgp表达和核p53积累常常同时发生在同一种瘤细胞内，在全部50例乳腺癌病例中，p53和pgp表达显著相关，认为pgp和突变型p53共同表达，属于一系列分子事件，导致更加侵袭的表型、药物耐药性和差的预后。oka m20等用免疫组化方法检测40例结肠癌组织，结果pgp表达与p53蛋白积累正相关，支持在体外培养突变型p53激活mdrl基因的论点。而在小儿实体瘤中，p53基因可能对dmrl基因也有调控作用，有待进一步研究。 总之，p53基因和pgp与肿瘤的发生、发展、肿瘤耐药性有密切关系，检测pgp和p53基因突变对肿瘤的早期诊断、预后判断等方面均展示了广阔的前景，可为化疗方案制定了体化提供理论依据，同时对肿瘤细胞mdrl基因和p53基因的进一步研究，将有助于阐明肿瘤发生发展和肿瘤耐药的分子基础，为肿瘤的基因治疗提供坚实的基础。 主要参考文献 1goldstein lj, curr probl cancer ,1995;19(2):65124 2oda y, rose i, radig k,et al. virchowsrch, 1997;430(2):99105 3re gg,willingham mc, bahtimi r, et al. mod pathol ,1997;10(2):129136 4volmm m .zintl f, edler l, et al. med pediatr oncol,1997;28(2):117126 5serra m, scotlandi k, manara mc,et al. eur j cancer, 1995;31a(12):19982202 6miniero r, massara fm ,saroglia em,et al.minerva pediatr ,1994;46(10):463470 7maia rc, carrico mk,klumb ce, et al. j exp clin cancer res,1997;16(4):419424 8bardeesy n, falkoff d, petruzzi mj ,et al. nat genet ,1994;7(1):9197 9bahtimi r, hazen mar tin dj, re gg, et al. mod pathol ,1996;9(3):238244 10govender d, harilal p, hadley gp, et al. br j cancer ,1998;77(2):314318 11lahoti c, thorner p, mal