应用于PCR技术的DNA聚合酶

合合 肥肥 学学 院院 Hefei University 基基因因工工程程 题题 目目 应用于应用于 PCRPCR 技术的技术的 DNADNA 聚合酶聚合酶 系系 别别 专业班级专业班级 学学 号号 姓姓 名名 指导教师指导教师 20152015 年年 1212 月月 2626 日日 应用于应用于 PCRPCR 技术的技术的 DNADNA 聚合酶聚合酶 摘要摘要DNA 聚合酶作为聚合酶链式反应 PCR 的重要因素之一 在 PCR 过程中起着至关重要 的作用 在某种意义上甚至可以说 PCR 技术就是耐热 DNA 聚合酶的技术 故综合研究聚 合酶并改善其酶学性能 已成为分子生物学工作者关注的热点之一 本文就 PCR 技术产生 至今 DNA 聚合酶的研究历史及现状进行简要综述 关键词关键词 PCR DNAPCR DNA 聚合酶聚合酶 酶学特性酶学特性 1 1 DNADNA 聚合酶的分类聚合酶的分类 从大肠杆菌 DNA 聚合酶工被分离和鉴定至今的 50 年时间里 已有 100 多个 DNA 聚合酶 相关基因被克隆和测序 它们分别来自于嗜热极端细菌和古细菌 多种天然的和重组的耐 热 DNA 聚合酶也被鉴定和纯化 这些酶大部分是单体酶 在溶液中的分子量一般为 80 一 115KD 人们根据核普酸序列将大肠杆菌酶 DNA 聚合酶划分为四类 即 DNA 聚合酶工 Family A DNA 聚合酶 II Family B DNA 聚合酶 III Family C 和其它的 Family X DNA 聚合酶工主要参与 DNA 损伤的修复 同时在半保留复制中起辅助作用 DNA 聚合酶 II 堤 DNA 复制的主要酶 4 与大肠杆菌 DNA 聚合酶工同源的为 A 群 该群除 酵母线粒体 DNA 聚合工 外 都来自于原核生物 对双脱氧核普酸抑制剂敏感 因此可用于 DNA 序列分析 包括 E col 栖热菌属 Themus 的 DNA 聚合酶 I 芽胞菌属 Bacillus 的 DNA 聚合酶 I 噬菌体 T5 以及升 DNA 聚合酶等 与大肠杆菌 DNA 聚合酶 II 同源的为 B 群 对双脱氧核普酸不敏感甚 至可以接受诸如双脱氧一 UTP 生物素一 dUTP 或荧光标记的 dUTP 等修饰过的核普酸 因此这类 DNA 聚合酶可用于聚合酶链式反应制备或标记核普酸 与大肠杆菌 NA 聚合酶 II 洞源的为 C 群 C 群可分为两个亚群 即以蛋白质引导的 protein prime 和以 RNA 引导的 RNA prime DNA 聚合酶 此外真核生物的俘一 NA 聚合酶是已知最小的 DNA 聚合酶 只 有 335 个核普酸残基 与其它 DNA 聚合酶缺乏同源性 曾单列为 X 群 目前发现的耐热 DNA 聚合酶均属于 A 群或 B 群 属于 A 群的都来源于真细菌 如来源 于栖热属的 Taq Thermnus aquaticus Tth T themnophilus Tca T caldophilus Tfl T flavus Tfi T filiformis 以及来源于芽胞菌属的 Bst Bacillus stearothermnophilis 属于 B 群的耐热 DNA 聚合酶均来源于古细菌 如来源于高温球菌 属的 Tli Theymococcus litoralis 5 焦热球菌属的 Pfu Pyrococcus furio sus 和 KOD1 Pyrococcus sp 硫叶菌属的 Sac Sulfolobus acidocaldarius 和 Sso S solfataricus 等 大量来自 B 群的 DNA 聚合酶被称为 a like DNA 聚合酶 因为它们都具 有一个保守的真核 a DNA 聚合酶氨基酸序列 这些 DNA 聚合酶都已经广泛应用于 PCR 技术 中 2 2 早期应用于早期应用于 PCRPCR 技术的技术的 DNADNA 聚合酶一聚合酶一 KlenowKlenow 片段片段 1957 年 A Kornberg 等从大肠杆菌中分离出了一种以 NA 为模板催化单核普酸聚合的 酶 称之为 Kornberg 酶 它是由单一多肤组成的球蛋白 相对分子量为 103000Kd 活性 区域位于 Leu516 和 His920 之间 包括三种不同的酶活性 即 5 3 聚合酶活性 5 3 外切酶活性和 3 5 外切酶活性 与其它种类的 DNA 聚合酶一样 其催化单核普酸聚 合的反应需要引物的存在 并且在 37 时聚合活性最高 催化单核普酸聚合的速率为 1000nt min Kornberg 酶即为 DNA 聚合酶工 聚合酶工可被枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶裂解成两个活性片段 较大的 C 端片段称为 Klenow 片段 它仍具有 5 3 聚合酶和 3 5 核酸外切酶活性 但失去了 5 3 核酸 外切酶活性 较小的 N 端片段只有 5 一 3 核酸外切酶活性 Klenow 片段就是早期应用 于 PCR 的 DNA 聚合酶 但是 Klenow DNA 聚合酶的缺点是在 37 下催化 NA 的合成 在 60 时很快就失活 故每一轮 PCR 都需要追加 Klenow DNA 聚合酶 使 PCR 过程繁琐而复杂 同时其亲核反应的掺错率也居高不下 正因为上述缺点而限制了该酶在 PCR 反应中的应用 其后人们也曾将肠 DNA 聚合酶和肠 DNA 聚合酶应用于 PCR 反应 但是终因它们的热稳定性 差而没能得到推广应用 3 3 耐热耐热 TaqTaq DNADNA 聚合酶的发现和应用聚合酶的发现和应用 Themus aquatics 是一种热栖的可在 70 95 下生活的水生真细菌 1988 年 Band II K Saiki 等从 Thenmusaquatics 中分离纯化到了 Taq DNA 聚合酶 并将其应用于 PCR 技 术 取代了大肠杆菌 Klenow 片段 使 PCR 过程实现了自动连续循环 Taq DNA 聚合酶基因 全长 2496bp 编码 832 个氨基酸 蛋白分子量为 94 Kd 以 Mg2 作辅助因子 属于 DNA 聚 合酶家族 A 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 有非常高的同源性 其功能区域在 287 832 氨基 酸之间 它是一种极端耐热的 DNA 聚合酶 在 92 5 酶活性可持续 130min 95 可保持 40min 97 5 5 6min 仍可保持约 50 酶活性 Taq 酶是第一个被应用于 PCR 的高热 稳定 DNA 聚合酶 也是活性最高的一种耐热 NA 聚合酶 具有 3 5 聚合酶活性和 3 5 外切酶活性 同时还存在非模板依赖性活性 但缺乏 3 5 外切酶活性 所以在 NA 合成过程中对单核普酸错配没有校正功能 每一循环错配率高达 2X10 核普酸碱基 不能 很好地保证 PCR 产物的保真性 并且对于短距离 PCR Taq DNA 聚合酶尚可以 但对于长距 离的片段 6kb 以上的片段 就无法完成 近年来利用基因工程方法已经获得了缺少 5 3 外切核酸酶活性和具有 3 5 外切核酸酶活性的 Taq 酶 从而拓宽了 Taq 酶的应用范围 由于 Taq DNA 聚合酶的发现 PCR 技术才真正得以推广和应用 4 4 有校正功能的耐热有校正功能的耐热 DNADNA 聚合酶应用干聚合酶应用干 PCRPCR 技术技术 自 PCR 技术问世以来人们一直在不断地寻找酶学性能好 保真度高的 PCR 用 NA 聚合 酶 继 Taq DNA 聚合酶之后 人们又陆续发现了 Vent Deep Pfu Tg 和 KODI 等耐热 的有校正功能的 NA 聚合酶 Pfu DNA 聚合酶是从喜温的古细菌 Pyrococcus furiosus 中获得 因其超强的纠错功 能等特性受到人们极大的关注 该酶为 2 个蛋白亚基 CP45 和 P50 的多聚体 含 775 个氨 基酸 分子量为 90KD Pfu DNA 聚合酶热稳定性极强 有 5 3 聚合酶活性和 3 5 外切核酸酶活性 所 以在催化聚合反应的同时可纠正聚合反应过程中的错误掺入 Pfu 酶以其比其它校正酶低 2 60 倍 比 Taq DNA 聚合酶低 6 一 100 倍的低错误率显示出极高的保真度 所以与其它的 聚合酶相比 它使产物的错配率大大降低 特别是进行 2kb 以内的 DNA 片段的扩增 效果 甚佳 来自 Pyrococcus Sp 的 KOD1 是另外一个具有强的校正功能 NA 聚合酶 其聚合酶基 因含有一个由 5013 个碱基组成的开放阅读框 编码 1671 个氨基酸 分子量为 193 2KD 比已知的其它耐热 DNA 聚合酶平均分子量大许多 其氨基酸序列与来自于 Thetmococcus litoralis 的 Tli DNA 聚合酶有 78 的同源性 该酶属于聚合酶家族的 A 群 具有很强的 3 5 外切酶活性 而没有或有极弱的 5 3 外切核酸酶活性 Zo 211 o KOD 酶热稳定 性极强 在 95 和 100 的活性半衰期分别是 12h 和 3h 其最适延伸温度为 75 延伸反 应的最适 pH 是 6 5 单核普酸聚合反应的错误掺入率与 Pfu 酶的相当 但是具有比 Pfu 酶高的延伸速率和持续合成能力 5 5 耐热耐热 DNADNA 聚合酶应用于聚合酶应用于 PCRPCR 技术所遇问题及展望技术所遇问题及展望 近年来随着以测序为主要内容的人类基因组计划 Hwnan Genome Project HGP 完成 HGP 已进入了以基因功能研究为主的功能基因组学和蛋白质组学研究阶段 预计在未来 10 20 年里 人类将解读绝大多数模式生物的遗传密码 对于基因组功能的研究是人类系统 全面地解读和研究生命遗传物质的宏伟计划 具有重大的科学意义 经济效益和社会意义 因此世界各国都投入巨大的资金用于此项研究 但是 目前的主要困难之一是普通耐热聚 合酶对高 GC 和高 AT 碱基对含量基因组 DNA 和 cDNA 扩增困难 还不能实现对上述特点基因 组 DNA 和 cDNA 的顺利扩增 并且到目前为止尚无较好的解决办法 故综合研究聚合酶改善 其酶学性能 通过获得适于扩增高 GC 和高 AT 碱基对含量基因组 DNA 和 cDNA 的聚合酶 解 决上述基因组研究过程中的问题 具有一定的理论意义和实际应用价值 6 6 小结小结 酶的开发利用是现代生物技术的重要内容之一 利用基