抗体药物偶联物的制备研究

,抗体药物偶联物的制备研究,班级：学生：学号：,河北科技大学本科论文答辩,目录,实验分以下几项进行介绍,3.实验结果与讨论,1.引言,2.实验部部分,4.实验结论,1.1课题背景,本课题是对抗体药物偶联物的制备进行研宄，主要内容如下：从众多检测蛋白的方法中挑选出适用于检测抗体还原后产物的最优方法。采用常用的还原剂对抗体进行还原，检测抗体不同时间下还原程度，得出最优还原反应时间以及还原过程的动态变化。对反应温度，反应pH，还原剂与抗体的还原比例进行响应面试验设计，优化反应条件，从常用的九种还原剂中筛选出高效的还原剂，用来连接带有马来酰亚胺接头的药物，进行抗体药物偶联物制备实验。,2.1实验机理,抗体被还原到合适的程度后，进行与药物的偶联反应，通常在pH 78左右，反应温度0C下反应1h。例如如果抗体被还原到4巯基/抗体，通常加入4-5倍的马来酰亚胺接头的药物反应30min1。其中采用二甲基甲酰胺（DMF)或者二甲基乙酰胺（DMAC)先将药物溶解，然后与抗体还原后的产物反应2，3。加入过量的小分子硫醇进行猝灭，来阻止马来酰亚胺与抗体上的巯基进一步反应，药物接头的马来酰亚胺被猝灭后，接下来的步骤就是要除去多余的药物接头以及有机溶剂，EDTA等添加物。,由于药物的成分、均一性与药物的安全以及药物的疗效息息相关，因此对抗体药物偶联物的组成、非均一性分析越来越被重视4 。疏水色谱柱TSKgelButyl -NPR (4.6mm X 3.5 cm)以对蛋白的高速、高分辨率的分离性能为广大研宄人员提供了帮助。它以表面键合有丁基的、粒径为2.5的非多孔型亲水性树脂作为填充剂。,2.2实验方案,分别取浓度为26.6mg/mL的IgG75pL分装至离心管中，TCEP和DTT用PB7.0缓冲液配置成10mM溶液，然后稀释至1mM，将药物溶于N, N-二甲基甲酰胺配成浓度为2 mM的溶液。还原反应：将还原剂按表中比例加入到IgG溶液中，补充缓冲液至总体积为150pL，用移液枪吹打混匀，将反应体系放置到37C恒温摇床中，180转速下反应2h。SDS-PAGE检测是否被还原。在反应体系中取出5pL稀释至20pL，加入非还原电泳上样缓冲液，进行SDS-PAGE，检测还原反应程度5 。,采用3K超滤管超滤膜在4000g转速下离心至少5次，以除去未反应还原剂。同时将整个反应置换成Tris-HCl 8.0的缓冲体系中。加入不同比例2mM药物142B1，Drug：IgG比例分别为4、5、6。比例和体积如表中所示，加入Tris-HCl pH8.0至反应体系为200pL (表4-3)。采用混匀器混匀后，将反应体系放置到37C恒温摇床中，180转速下反应1h。向最终的反应体系中加入半胱氨酸，使其中浓度达到1mM，猝灭未反应的药物。反应后的样品采用BCA法检测浓度。,实验药品及其规格,2.3实验药品和仪器,2.4分析方法,2.4.1、蛋白浓度测定,蛋白浓度采用BCA方法测定。具体步骤为：分别在96孔板的每个孔中加入20pL 不同浓度（0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL 和 1.0mg/mL)的蛋白标准品(BSA标准溶液2mg/mL)和待测样品和空白对照，然后加入200pL工作液（A液:B液=50:1)，将96孔板放置于37C的恒温培养箱中反应0.5h。将酶标仪的检测波长设为562nm，在该波长下检测每个孔中蛋白质的吸光值。然后根据标准蛋白的浓度和测出的吸光值，绘制蛋白质浓度标准曲线。从标准曲线计算得到检测样品的浓度。,SDS-PAGE是依据通过SDS使蛋白质分子带上大量负电荷中和蛋白质分子本身电荷，消除蛋白质分子本身的电荷效应。依据蛋白质的分子大小呈现不同条带。通过凝胶成像系统所得图片蛋白带的宽度以及颜色的深浅，采用光密度分析可以判断出蛋白带大约的蛋白量。采用非还原的SDS-PAGE电泳，浓缩胶为8%的聚丙烯酰胺凝胶，分离胶为12%的聚丙烯酰胺凝胶。样品缓冲液中不含巯基乙醇6 。取20pL(0.1mg/mL0.5mg/mL)蛋白样品加适量的样品缓冲液在100C下煮沸5min， 8000g高速离心5min后上样。考马斯亮蓝染色，染色剂为考马斯亮蓝R-250。,2.4.2、聚丙烯酰胺凝胶电泳,2.4.3、疏水作用层析,层析前样品处理：采用BCA法检测抗体与药物偶联后产物的浓度，将产物用PBS稀释到1mg/mL7 。采用0.22pm的超滤膜过滤，除去样品中杂质。采用分析柱TOSOH TSKgel Butyl-NPR检测抗体与药物偶联后的各个产物的生成情况，液相系统为AKTA Explorer 100。分析条件：流动相为 Buffer A: 1.5M (NH4)2S4，50mM KHPO4，pH 7.0，BufferB: 50mM KHPO4，pH 7.0 加入 20% 异丙醇。,考察样品中加入不同硫酸铵含量对分析结果的影响。加入不同比例2 M硫酸铵缓冲液(2.0 mM Na2HPO4-NaH2PO4磷酸缓冲液中加入2M硫酸铵调pH 7.0)和PB(20 mM pH 7.0 Na2HPO4-NaH2PO4磷酸缓冲液），最终浓度硫酸铵分别为0.5、0.8、1.0、1.3、1.5M。考察流速为0.2、0.4、0.6、0.8、1mL/min时，系统压力的变化，分析柱对抗体与药物偶联后生成产物的情况，室温检测，检测波长为280nm，进样体积为50pL，浓度1mg/mL，总蛋白进样量为50昭。,2.4.4、反相色谱分析,层析前样品处理：采用BCA法检测抗体与药物偶联后产物的浓度，将产物用PBS 稀释到 2mg/mL。100L 2mg/mL IgG 在 PBS 溶液中与 100pL 50mM DTT 在37C，反应20min，0.22m的超滤膜过滤，除去样品中杂质。上样20L，280nm检测。采用反相色谱柱 PLRP-S 1000A，8mm，150mmx4.6mm，P/N PL1512-3802 检测，方法：Buffer A: H2O + 0.1% TFA，Buffer B: CH3CN + 0.1% TFA，梯度： 30-45%B 30min，95%B 3 min，30%B 5min。,实验结果与讨论,3、实验结果与讨论,盐浓度的高低直接影响疏水吸附能力的大小，盐浓度太高疏水性强，不宜洗脱；而盐浓度太低疏水性弱，不宜吸附。因此要选择适宜的盐浓度。当样品中分别含有不同盐浓度0.5、0.8、1.0、1.3、1.50M硫酸铵时，进行HIC分析，当盐浓度为0.5、0.8、1.0 M时，样品不能吸附在介质上，基本全部流穿，当为盐浓度为1.5M，洗脱峰中出现不同的抗体药物偶联物，因此，选择样品上样时盐浓度为 1.5M。,3.1疏水作用层析硫酸铵浓度的选择,3.2疏水作用层析流速的选择,采用HIC进行分离过程中，流速能够影响不同药物偶联物之间的分离度，流速一般在0.21mL/min之间变化，在流速0.21mL/min变化时，系统压力逐渐上升，压力如图4-1所示，当流速超过0.8mL/min时，系统压力达到10MPa，已经接近AKTA层析系统耐受压力。流速在0.6mL/min时，系统压力在8MPa，在层析系统和分析柱的耐受压力范围内，但是，不同药物偶联物的峰分离度很差，不能将各个产物很好的分开。当流速为0.2mL/min时，分析时间延长，综合考虑各个因素选择最优流速为0.4mL/min。,3.3抗体药物偶联物疏水作用分析,在流速0.4mL/min，样品中盐浓度为1.5M硫酸铵的条件，采用AKTAPurifier100层析系统对样品进行分析。不同载药量的抗体药物偶联物按照疏水性的强弱先后被洗脱下来，从而得到不同的检测峰。抗体还原后的巯基是成对出现，因此，偶联的药物数量分别是0，2，4，6，8个，分别记为D0，D2，D4，D6， D8。出峰先后顺序为D0，D2，D4，D6，D8，见图4-4。每个抗体分子的平均药物载量可以通过构成峰的积分面积和每个峰的药物载量作为加权因子来计算，通过工作站分析得出各个峰面积，见表4-2：,药物载量计算以IgG： DTT： Drug=1:3:6为例进行计算,通过上式计算出不同反应每个抗体分子上平均偶联上的药物数量。图4-2由下及上分别是 IgG: DTT： Drug=1:1.5:3、1:2.5:5、1:3.5:7、1:3:6。通过分析可知，当IgG： DTT： Drug=1:1.5:3时，偶联到抗体上的药物很少，基本检测不出，当IgG： DTT： Drug=1:2:4时，平均每个抗体上的药物数量为1.65，当IgG： DTT：Drug=1:2.5:5时，平均每个抗体上的药物数量为2.22，当IgG: DTT： Drug=1:3:6时，平均每个抗体上的药物数量为3.56，因此，当IgG： DTT： Drug=1:3:6时，平均每个抗体上的药物数量符合要求，因此，采用DTT作为还原剂还原抗体并偶联上药物的最佳比例为IgG： DTT： Drug=1:3:6,3.4反相色谱分析,反相色谱也是基于抗体载药量的不同来来分离的，载药量越高的ADC，保留时间越长，与HIC的根本不同是反相色谱是在还原的条件下分离的，此时抗体的重链轻链是分离的，并没有共价结合为一体，因此重链轻链是分别洗脱下来的。部分还原后偶联药物生成的药物偶联物是一个依靠链间的共价键结合在一起的复杂的混合物，从该混合物中的物种衍生的反相色谱图很难解释，所以这个方法的样品制备包括DTT处理的步骤，以减少任何其它分子间的二硫化物。样品完全还原后，所有的抗体以单独的链进行洗脱。所有的重链轻链连有不同数量药物，重链H，轻链L，重链连有1个药物H1，依次类推，产物有L0，L1，H0，H1， H2，H3分别计算出来，由工作站得出每个峰面积，当IgG:DTT:Drug=1:2:4时，每个峰面积如表4.5所示，由下式可得出每个抗体上连接药物数量。图4.3中，,由上至下依次为 IgG, IgG:DTT:Drug=1:1.5:3，IgG： DTT: Drug=1:2:4，IgG： DTT: Drug=1:2.5:5，IgG： DTT： Drug=1:3:6。,通过分析计算，当IgG:DTT:Drug=1:1.5:3时，偶联到抗体上的药物很少，基本检测不出。当IgG: DTT： Drug=1:2:4时，平均每个抗体上的药物数量为1.23，当IgG： DTT： Drug=1:2.5:5时，平均每个抗体上的药物数量为2.12，当IgG：DTT： Drug=1:3:6时，平均每个抗体上的药物数量为3.56。这与疏水作用层析数据基本接近，因此，当IgG：DTT：Drug=1:3:6时，平均每个抗体上的药物数量符合要求，因此DTT作为还原剂还原抗体并偶联上药物的最佳比例为IgG:DTT：Drug=1:3:6。,4、实验结论,本章在还原剂还原抗体的最优条件下，进行抗体与药物的偶联反应，采用疏水作用层析和反相高效液相色谱对偶联药物后的抗体进行检测，确定了抗体药物偶联物的合适的检测方法，并且计算得出了平均每个抗体所连接药物数量。所得结论有以下三点：通过不同流速，样品中含有不同盐浓度进行疏水层析方法的优化，确定采用疏水层析分析抗体药物偶联物的分析条件：流动相为Buffer A: 1.5M (NH4)2SO4，50mM KHPO4，pH 7.0，Buffer B: 50mM KHPO4，pH 7.0 加入 20%异丙醇，流速0.4mL/min，样品中盐浓度为1.5M硫酸铵，蛋白浓度1mg/mL。上样 50pL，280nm 检测。,通过反相色谱柱PLRP-S检测，分析方法：BufferA: H2O + 0.1% TFA BufferB: CH3CN + 0.1% TFA 梯度:30-45%B 30min，95%B 3 min，30%B 5min样品处理 100pL 2mg/mL IgG 在 PBS 溶液中与 100pL 50mM DTT 在 37C反应20min后上样20pL，280nm检测。通过不同还原剂比例进行抗体还原，然后进行药物偶联，进行疏水作用层析和反相高效色谱进行分析，当IgG: DTT： Drug=1:3:6时，通过分析计算，平均每个抗体上偶联的药物为3.56。,参考文献,（1）Wilbur, D. S., Chyan, M. K., Nakamae, H., etal, Reagents for Astatination ofBiomolecules. 6. An Intact Antibody Conjugated with aMaleimido-closo-Decaborate(2-) Reagent via Sulfhydryl Groups Had ConsiderablyHigher Kidney Concentrations than the Same Antibody Conjugated with anIsothiocyanato-closo-Decaborate(2-) Reagent via Lysine Amines, Bioconjugatechemistry,2012, 23(3):409-420.（2）Hamann, P. R., Hinman, L. M., Beyer, C. F., etal, An anti-CD33antibody-calicheamicin conjugate for treatment of acute myeloid leukemia. Choice oflinker, Bioconjugate chemistry,2002, 13(1):40-46.（3）Fleming, M. S., Zhang, W., Lambert, J. M., etal, reversed-phasehigh-performance liquid chromatography method for analysis of monoclonalantibody-maytansinoid immunoconjugates, Anal Bi