植物基因工程技术及应用.ppt

二 植物基因工程技术及应用 1 植物基因工程技术先将特定的目的基因分离 然后利用载体 媒体或其它的物理 化学方法将分离的目的基因导入植物细胞受体 并整合到植物受体细胞的染色体 基因的载体 上 从而获得目的基因在植物受体中的表达 最终达到改变植物性状 如抗并抗虫 抗逆等 以及快速培育植物新品种的目的 2 转基因植物是拥有来自其他物种基因的植物 指通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物 2008年中国转基因作物种植面积为世界第六位 作物品种包括棉花 番茄 杨树 牵牛花 抗病毒木瓜和甜椒 转基因植物 种植的转基因植物种类主要有大豆 占54 玉米 占28 棉花 占9 油菜 占9 马铃薯 西葫芦和木瓜的比例都小于1 按转基因植物的性状划分 抗除草剂占71 抗虫占22 抗虫兼抗除草剂占7 抗病毒和其他性状转基因植物的比例小于1 至1999年 农业部批准可进行商业化生产的国内研制的转基因植物有5种 它们分别是 抗虫棉花 改变花色的矮牵牛 延熟番茄 抗病毒的甜椒和番茄 一 转基因植物发展进程与规模 1983年 首批转基因作物 烟草 马铃薯 问世 1986年 首批转基因作物 抗虫 抗除草剂 进入田间实验 美国和法国同时对抗除草剂转基因烟草进行了田间试验1992年 中国首先在大田种植转基因抗病毒烟草 揭开了全球转基因作物商业化的序幕 1994年 美国转基因作物产品 耐储存番茄FlavorSavor 进入市场 1994年 商品化种植抗黄瓜花叶病毒 CMV 和抗烟草花叶病毒 TMV 双价的转基因烟草1996年后 转基因作物的产业化得到迅速发展 同时带有八种基因代码的转基因玉米将于2010年在美国问世 1998年 全世界共有7000万英亩大田种植转基因作物 1999年又增至9860万英亩 年增长率超过40 2000年年增长率突降至10 8 其中美国的降幅最大 2009年2月24日统计种植面积排名前三位的国家分别为 美国 6250万公顷 阿根廷 2100万公顷 和巴西 1580万公顷 中国全国生物技术作物种植面积达380万公顷 在全球生物技术作物种植面积超过100万公顷的八个国家中排名第六种植面积排名前十的国家 依次是美国 阿根廷 巴西 加拿大 印度 中国 巴拉圭 南非 乌拉圭 菲律宾 商业化种植转基因作物的国家数 年份 国家数 亿美元 国际农业生物技术应用跟踪调查服务处 ISAAA 的估计 全球转基因产品的市场 转基因产品市场现状与展望 美国是转基因食品的发源地 也是当今世界转基因食品生产和出口最多的国家 1983年 全球第一个转基因农作物 马铃薯就诞生在美国 据估计 目前美国的零售食品中有60 以上含有转基因成分 90 以上的大豆 50 以上的玉米 小麦是转基因的 采用现代生物技术手段 培育出一批优质 专用 高产 多抗农作物新品种 转基因技术与产业化快速发展 我国已成为世界第五大转基因植物种植国家 2006年 我国棉花种植面积8095万亩 其中生物技术棉花种植面积已超过总面积的75 河北 山东 河南 安徽等棉花主产省的国产生物技术棉花种植率已达到100 棉花单产达到80千克 亩的历史高水平 增幅为6 3 7 0 棉花总产量达650万吨 创历史新高 且棉花品质普遍看好 通过数字农业技术的应用 大幅度提高了示范区农业信息化和现代化管理水平 加速了利用高新技术改造传统农业的步伐 1 提取DNA 二 转基因技术 有SDS法和CTAB法 常采用CTAB法提取方法基因组DNA 并用分光光度计测定浓度和质量 然后用去离子水将其稀释至50ng uL 1备用 叶片加液氮 快速研磨成粉末 DNA提取缓冲液2 CTAB 充分混匀 60 水浴45 60min 其间轻柔摇匀2 3次 冷却至室温 加入等体积氯仿 异戊醇 24 1 轻柔且充分混匀 静置10min 12000rpm离心10min 取上清 加入0 7倍体积的冷异丙醇 轻柔摇动离心管充分混匀 室温放置10 20min 10000rpm离心10min 小心弃去上清 加入70 的乙醇洗涤2次沉淀 室温下微干 溶于适量TE缓冲液 DNA检测用0 8 的琼脂糖胶 15000bp1000bp250bp 1 获得目的基因方法 从生物基因组群体中分离目的基因采用限制性内切酶切割 2 获得目的基因 DNA1 g 缓冲液2 L 重蒸水 酶液 用手指轻弹管壁使溶液混匀 使溶液集中在管底 混匀反应体系后 37 水浴保温2 3h 电泳检测 EP管编号 加样 操作步骤 化学合成目的基因DNA片段采用DNA合成仪 PCR 聚合酶链式反应 合成DNA常用的方法 PCR过程示意图 mRNA差异显示法获得目的基因基因在细胞中的特异表达与否 决定了生命历程中细胞的发育和分化 细胞周期的调节 细胞衰老和死亡等 用于分离特异表达的基因 用机械的方法如超声波把基因组打成片段 2 PCR获得目的基因 设计引物在NCBI 美国国立生物技术信息中心 引物设计软件Primerprimer5 0设计引物 然后合成引物 PCR反应混合液 扩增条件 94 60s 37 60s 72 120s 共25 30个循环 PCR 特异片段的回收 连接与转化 将扩增产物用1 琼脂糖凝胶 EB染色 在100V电压的电泳液中电泳40min 在紫外灯下用刀片切取带有特异带的胶块 并把该胶块转移到1 5ml离心管中 回收片段按照胶回收试剂盒进行 目的片段与克隆载体的连接 pGEM Teasyvector或pMD18 T 在4 条件下连接12h 16h 采用热激法 将连接产物的转化转化至大肠杆菌的感受态细胞E coliJM109 将全部菌液涂于含Amp X gal为40 l IPTG为4 l 的LB平板上 半小时后倒置 37 培养8 12h左右 可出现菌落 克隆的筛选与鉴定 蓝白斑筛选重组子的PCR鉴定质粒的提取及质粒的酶切鉴定 测序送生物技术公司 用DNA测序仪测序 序列比对在NCBI或者DNAman上进行比对 确认基因是否正确 3 构建植物表达载体 1 载体在基因工程重组DNA技术中将DNA片段 目的基因 转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子 三种最常用的载体是细菌质粒 噬菌体和动植物病毒 按用途分为 克隆载体 表达型载体 分泌型载体 穿梭载体等 一是用它作为运载工具 利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制 称为克隆 在宿主细胞中能保存下来并能大量复制 有多个限制酶切点 而且每种酶的切点最好只有一个 可适于多种限制酶切割的DNA插入 含有复制起始位点ori 能够独立复制 有一定的标记基因 便于进行筛选 载体必须具有四个条件 能独立复制并稳定传代 复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝粒 端粒方便插入外源片段 酶切位点选择标记 药物抗性报告基因 插入筛选标记易分离提取高产率 多拷贝 强启动子多宿主 Transform reportgenesubstrates 1 转化方式根据所用载体类型以及转化对象不同一般有以下主要转化方式 1 基因枪转化 2 电转化 3 融合法 4 花粉管转化 5 农杆菌介导 4 高等植物基因的转化与植株再生 1 基因枪转化法 利用基因枪的装置 将钨粉或金粉与DNA吸附制成 子弹 通过高压放电将 子弹 加速到482m s 在这种速度下 金属粒子能穿透植物细胞壁 击发一次可将成千上万个带有外源DNA的金属粒子同时射入完整的细胞或器官 优点 单子叶和双子叶都可使用缺点 成本高 操作麻烦 的DNA片段整合效率极低 通常只应用于单子叶 2 电击法 用电转化仪将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中 混合物在200 600V cm的电场中处理若干秒钟 然后将原生质体在组织培养基中生长1 2周 再生出整株植物 3 融合法 将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合 在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体 后者与植物细胞原生质体融合 筛选融合子 再生植物细胞壁 原生质体很难再生出整株植物 4 花粉管导入法 使用显微注射器 将外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵 合子或早期胚胎细胞中 实现基因的转移 是由我国科学家周光宇首先提出设计的 目前已应用于水稻 小麦 棉花 大豆 花生 蔬菜等作物的转基因研究 花粉管导入法的特点是直接 简便 它的受体材料为植株整体 省略了细胞组织培养的诱导和传代过程 排除了植株再生的障碍 特别适合于难以建立有效再生系统的植物 由于转化的是完整植株的卵细胞 受精卵或早期胚胎细胞 导入的DNA分子整合效率较高 5 农杆菌介导 几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤 这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌 A tumefaciens 感染所致 其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒Ti介导的 二元整合转化程序 将外源基因克隆在大肠杆菌 农杆菌穿梭质粒的T DNA区内 重组质粒直接转化农杆菌株 该菌株携带只含vir区不含T DNA区的Ti辅助质粒 2 农杆菌介导外源基因转移技术的一般操作 将表面消毒的叶片切成小块 小块在过夜培养并稀释到一定浓度的含外源基因的根癌农杆菌液中共培养几分钟 使让根癌农杆菌感染叶片切块的伤口 从菌液中捞出小叶块 培养基中培养2天 在含头孢霉素选择培养基中筛选转化细胞 继续培养 转化的细胞分化出芽 将芽转入含有抗生素的生根培养基上 诱导生根 将完整的转基因植株移栽到土壤中 a b c d 分子鉴定 PCRSouthernblotNorthernblotWesternblot蛋白质电泳 5 转基因植株的鉴定及分析 Southernblot Northernblot Westernblot和蛋白质电泳 三 转基因生物商业化的一般流程 1 实验室试验环节 通过了实验室的试验 技术成熟之后才开始进行中间试验环节 2 中间试验环节 这个环节在田间进行 一般需要两年左右的时间 田间的管理评价包括具体位置 与人群的距离 面积 隔离等多项具体规定 3 环境释放评价 需要两年 在这个环节试验可以再扩大一些面积 但也有很多要求 也必须在相对封闭的环境下进行 4 生产试验 生产试验的规模可以进一步扩大 本阶段的评价主要是评估转基因生物对环境是否有影响和压力 5 如果要做食品 需要再对独立性 致敏性 抗营养因子等进行评价 还需要提交综合性评价 按照中国现行的批准流程 转基因商业化的批准有年限控制 一般时限是4年 4年到期后 需要重新报批 四 种植转基因植物的风险性 破坏生态环境和影响人类的健康 1 安全性问题转基因植物存在的用于选择性标记的抗生素 以及导入植物的DNA序列在加工过程中可能出现的改变 2 环境及生态问题导入植物的目的基因是否转入其他植物 是否会破坏生态平衡 首先是毒性问题 一些研究学者认为 对于基因的人工提炼和添加 可能在达到某些人们想达到的效果的同时 也增加和积聚了食物中原有的微量毒素 其次是过敏反应问题 对于一种食物过敏的人有时还会对一种以前他们不过敏的食物产生过敏 比如 科学家将玉米的某一段基因加入到核桃 小麦和贝类动物的基因中 蛋白质也随基因加了进去 那么 以前吃玉米过敏的人就可能对这些核桃 小麦和贝类食品过敏 第三是营养问题 科学家们认为外来基因会以一种人们目前还不甚了解的方式破坏食物中的营养成分 第四是对抗生素的抵抗作用 当科学家把一个外来基因加入到植物或细菌中去 这个基因会与别的基因连接在一起 人们在服用了这种改良食物后 食物会在人体内将抗药性基因传给致病的细菌 使人体产生抗药性 第五是对环境的威胁 在许多基因改良品种中包含有从杆菌中提取出来的细菌基因 这种基因会产生一种对昆虫和害虫有毒的蛋白质 在一次实验室研究中 一种蝴蝶的幼虫在吃了含杆菌基因的马利筋属植物的花粉之后 产生了死亡或不正常发育的现象 这引起了生态学家们的另一种担心 那些不在改良范围之内的其它物种有可能成为改良物种的受害者 最后 生物学家们担心为了培养一些更具优良特性 比如说具有更强的抗病虫害能力和抗旱能力等 而对农作物进行的改良 其特性很可能会通过花粉等媒介传播给野生物种 三明治 事件 由含有抗虫性Bt基因的转基因玉米做成 这种玉米可产生一种Cryge蛋白质 此物是一潜在致过敏性源 所以美国食品与药品管理局 FDA 只批准这种玉米作饲料而非食用品 美国一家食品公司生产的一种油炸三明治 Taco 上下夹层是玉米粉 中间为肉馅 使人们对转基因作物及其产品的安全性问题充满了忧虑 转基因植物的几个典型事件 马铃薯 事件英国 独立报 披露了转基因食品巨头孟山都公司的一份秘密报告 不能确定转基因和非转基因的马铃薯化学成分有什么差异对使用转基因土豆的大鼠 没有补充蛋白质以防止饥饿供试动物数量少 饲喂的几种食物都不是大鼠的标准食物试验设计差 未作双盲测定统计方法不当 试验结果无一致性 试验错误 含雪花莲凝集素基因的土豆 体重和器官减轻 免疫系统受到破坏 斑蝶 事件 1999年 月 康奈尔大学的一个研究组在 Nature 杂志上发表文章 但2年后美国组织了多个大学和研究部门进行了大量试验 得出了科学的结论 玉米花粉重 扩散不远田间试验表明 抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁 转基因抗虫玉米的花粉 马利筋 44 幼虫死亡 北美珍稀濒危大斑蝶 杂草 斑蝶幼虫真正的死因 农药使用过度生态环境的破坏 五 转基因植物的安全评价与检测 安全性评价主要包括两部分 一是对人类健康的影响 一是对环境的影响 这是由授权的第三方机构进行的安全性研究 对农业转基因生物实施安全管理是国际上的普遍做法 国际经合组织 OECD 联合国粮农组织 FAO 环保规划署 UNEP 生物安全议定书 食品法典委员会 都对转基因生物的安全提出了明确的要求 安全性评价是国际上的通行做法 由于各国农业 环境和生物多样性的差异 决定了只有本国确认了安全性之后 转基因生物才能投入商业应用或由输出国引进 日本 欧盟 美国等国均实行安全性评价 美国是通过农业部 食品与药物管理局和环保局的安全评价后才允许转基因作物商品化生产 欧盟是通过安全评价后才批准国内外的转基因产品投放市场 日本是通过农林水产省的安全评价后才许可转基因农产品进口 目前 按照 生物安全议定书 的有关规定 对进口农业转基因生物实施安全评价管理 可以在收到申请之日起270日内做出批复 我国在制定 条例 及其配套规章的过程中 对国外的相关法规进行了比较研究 在安全评价中 遵循 个案分析 的原则 实质等同性 原则 逐步完善 的原则等 实行标识管理制度是使消费者有知情权和选择权 转基因的管理是casebycase 个案分析的原则 即使同一个品种在不同的地方 不同的批次都需要进行评价 实质等同性原则 转基因植物生产的产品与传统产品同一性状进行比较 具有实质等同性 则可以认为是安全的 农业转基因生物管理文件 国务院在2001年就颁布了 农业转基因生物安全管理条例 下称 条例 条例 规定 国家农业转基因生物安全委员会 下称安委会 负责我国农业转基因生物的安全评价工作 2002年 农业部又发布了 农业转基因生物安全评价管理办法 农业转基因生物进口安全管理办法 和 农业转基因生物标识管理办法 三个配套规章 我国还建立了由农业部 国家发改委 科技部 卫生部 国家质检总局和国家环保总局组成的国家农业转基因生物安全管理部际联席会议制度 在美国 一种基因作物要投入生产 需要同时接受3项审核 农业部负责监管基因作物进行田间试验的结果 食品与药物管理局 FDA 负责对基因食品安全性的审核 而环保署则负责对该基因作物对环境影响的评估 凡是经过科学评价和政府部门严格审批获准上市的转基因食品都是安全的 全世界数亿人食用后没有出现一例转基因食品中毒或医疗事故 六 转基因植物商业化中存在的问题 1 转基因性状的失效问题 这种失效来自于两个方面 一方面是所转基因本身表达沉默或表达强度降低 另一方面是病虫草等对转基因性状的产生抗性 从而对转基因植物的商业化带来不利影响 2 转基因作物的产量品质问题 1994年底一个在美国批准商品化的转基因迟熟番茄上市之后 并没有像人每逾期得那样有效 所以在1997年就推出了市场 其原因是这种番茄产量偏低而经不起采收 包装及运输等整个过程 很多番茄在运抵目的地是已经软化或碰伤 失去了市场价值 3 经济地理问题 对不同发展水平的国家来说 转基因作物商业化的主要问题有一定的差异 如欧盟转基因作物的商业化主要是政府和公众对转基因作物的认识问题 而对贫穷的发展中国家则可能是经济问题 4 次要病虫害问题 由于转基因性状只是对个别性状的抗性 可能引起其它病虫害逐步演变成主要病害 七 转基因技术的应用 自 年首例转基因植物 烟草问世 2006年3月全球已有 多种植物获得转基因植株 美国是世界上第一个批准转基因农作物商业化种植的国家 其转基因作物种植面积一直居世界首位 年美国转基因作物种植面积达 万公顷 占世界转基因作物种植面积的 目前 最主要的转基因作物是大豆和玉米 这两种作物的种植面积大约占全球转基因作物总面积的 其中转基因大豆占全球转基因作物面积约 转基因棉花和油菜的种植面积位居第三和第四 转基因作物给人类带来了巨大的经济效益 自1983年首次获得转基因烟草 马铃薯以来 在短短十余年间 转基因作物的研究和开发进展十分迅速 至2008年国际上已获得转基因植株的植物已有超过35个科120多 其中 第一代 农业生物技术产品已进入研究开发实用阶段 第二代 转基因产品也基本上成形 研究方向 抗病毒方面 抗虫害方面 改良品质方面 抗逆境方面 抗除草剂方面 医疗保健方面 提高产量方面 第一代 第二代 1 1抗病毒方面 烟草花叶病毒的外壳蛋白基因 普通番茄 继抗烟草花叶病毒的番茄培育成功之后 抗黄瓜花叶病毒的转基因植株也陆续获得成功 我国科学家利用转基因方法 培育出了抗病毒烟草 抗病毒甜椒和抗病毒番茄 而且已进行了田间试验 并被批准进行商品化生产 1 2抗虫害方面 试验已证明 如果将苏云金杆菌杀虫蛋白与蛋白酶抑制剂配合使用 可提高杀虫2 20倍 效果更佳 可以预料 未来的发展趋势是将两类基因同时转入植物 以提高抗虫能力 1 3抗除草剂方面 有资料报道 农业上因杂草危害减产由40年代的8 上升为12 而我们广泛使用的除草剂大部分为非选择性除草剂 因此只能在作物播种前使用 而通过基因工程培育出了抗除草剂作物 不但可以降低化学除草剂的施用量 而且减少环境污染 还可以对轮作或兼作作物的选择给予更大的灵活性 目前已获得的转基因耐除草剂作物有大豆 棉花 棉田面积的 以上都是转基因抗虫棉 玉米 油菜 马铃薯 甜菜等 大多已进入了实用阶段 美国孟山都公司已经在河北和安徽建立了转基因抗虫棉合资公司 凭借其强大的技术优势和资本优势与我国抗虫棉公司进行竞争 1 4提高产量方面 超级水稻 在水稻基因中插入玉米高光效基因 从而使水稻拥有更高速度的光合作用 使大米产量提高了35 这项工程是由我国首先完成的 一种转谷氨酸脱氢酶基因的玉米 由于它可以大大提高对氮肥的利用率 所以其产量提高了10 1 5改良品质方面 一个被称作 金水稻 的转基因品种 孟山都等公司开发的 可以使食用者避免维生素A缺乏症 因为这种水稻通过转基因后高含胡萝卜素 人体可以将胡萝卜素转化为维生素A 再如 美国生物技术研究人员把月桂树基因导入油菜中 生产出含月桂酸油达40 的油菜籽 大大降低了成本并增加了产量 1 6医疗保健方面 2002年 我国报道一种 抗乙肝西红柿 在中国农科院生物技术研究中心培育成功 又被称为 口服疫苗 目前 在转基因植物中已表达的口服疫苗除乙肝病毒疫苗外 还有霍乱弧菌疫苗 肺结核疫苗 产肠毒素大肠杆菌疫苗 狂犬病毒疫苗 轮状病毒疫苗 麻疹病毒疫苗 呼吸道合胞病毒疫苗等 生产出口服疫苗的转基因作物有番茄 黄瓜 香蕉 还有马铃薯 烟草等 1 7抗逆境方面 针对旱 涝 盐碱 低温等不良因子而培育的各类抗逆作物也是