抗肿瘤药物研究及新药筛选

1 抗肿瘤药物研究及新药筛选 提 纲 一 化疗药物的发展 二 肿瘤的药物治疗 三 抗肿瘤药物筛选及评价 四 体外抗肿瘤活性试验 五 体内抗肿瘤活性试验 一 化疗药物的发展 近代肿瘤化疗学始于 20 世纪 40 年代 50 年代通过动物筛选化疗药物发现了 5FU MTX CTX 等 化疗学有了发展 60 年代认识到肿瘤细胞动力学及化疗药药代动力学的重要性 大部分目前所 用的抗癌药已发现 有急淋 HD 睾丸癌等可化疗治愈 70 年代形成肿瘤内科学 更多肿瘤有了比较成熟的化疗方案 80 年代研究以生物反应修饰剂等药物来提高化疗疗效 探索抗药性产生的原 因 5 肿瘤患者可治愈 90 年代新抗癌药进入临床 多药耐药基因发现 生物治疗 基因治疗辅助治 疗改善等 疗效进一步提高 二 肿瘤的药物治疗 1 细胞毒类抗肿瘤药 a 拓扑异构酶抑制剂 2 原理 真核细胞 DNA 拓扑异构酶 Topo 是生物体内及其重要的细胞核内酶 参与 DNA 复制 转录和修复等所有关键的核内过程 DNA 拓扑异构酶 已成为 重要的抗肿瘤药物研究新靶点 拓扑异构酶 抑制剂已成为高选择性抗肿瘤药 物研究的一个主攻方向 代表药物 喜树碱类化合物 对 S 期的毒性作用 这一作用需共价 TopoI DNA 复合物的形成和 DNA 复制 TopoI 抑制剂诱导的细胞凋亡而非 DNA 断裂是引起细胞最终死亡的原因 b 胸苷酸合成酶抑制剂 原理 胸苷酸合成酶 TS 把单磷酸脱氧尿嘧啶 DUMP 转换成单磷酸胸腺嘧啶 TMP 在 DNA 复制和细胞生长过程中起着关键作用 是已知抗肿瘤药物的 重要有效靶点之一 胸苷酸合成酶抑制剂导致了 DNA 断裂从而导致细胞死亡 代表药物 培美曲塞 它是一种结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂 通过破坏细胞内 叶酸依赖性的正常代谢过程 抑制细胞复制 从而抑制肿瘤的生长 体外研究 显示 培美曲塞能够抑制胸苷酸合成酶 二氢叶酸还原酶和甘氨酰核苷酸甲酰 转移酶活性 这些酶都是合成叶酸所必需的酶 一旦培美曲塞进入细胞内 它 就在叶酰多谷氨合成酶的作用下转化为多谷氨酸的形式 多谷氨酸存留于细胞 内成为胸苷酸合成酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶的抑制剂 多谷酸化在肿瘤 细胞内呈现时间 浓度性过程 而在正常组织内浓度很底 多谷氨酸化代谢物在 肿瘤细胞内的半衰期延长 从而也就延长了药物在肿瘤细胞内的作用时间 c 铂类抗肿瘤药物 原理 铂络合物产生抗肿瘤活性的原因 是由于其与肿瘤细胞 DNA 结合 从而干扰 DNA 的复制 抑制肿瘤细胞的分裂 代表药物 顺铂和奥沙利铂 2 以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物 3 a 蛋白酪氨激酶 PTK 抑制剂 原理 PTK 是一组酶系 能催化 ATP 上的磷酸基转移到许多重要的蛋白质的酪氨 酸残基上 使其残基磷酸化 从而激活各种底物酶 通过一系列反应影响细胞 的生长 增殖和分化 代表药物 依马替尼 依马替尼一种抑制 Bcr Abl 酪氨酸激酶的蛋白酪氨酸激酶抑制剂 Bcr Abl 酪氨 酸激酶是 CML 中由费城异常染色体引起的异常酪氨酸激酶 它能抑制 Bcr Abl 阳性细胞系和费城染色体阳性 CML 新鲜白血病细胞的增殖并诱导其凋亡 b 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 原理 通过扩散进入肿瘤细胞 与 EGFR 的胞内段激酶结合区结合 从而抑制 EGFR 受体的磷酸化 阻断受体下游信号通路的传导 发挥抗肿瘤作用 代表药物 吉非替尼 研究表明吉非替尼的作用通过上调 P27KIP1 和 P21CIP WAF1 的表达 导致细 胞 G1 期阻滞或诱导细胞凋亡 C 法尼基转移酶抑制剂 原理 法尼基转移酶是近年来发现的与 Ras 蛋白异戊二烯化修饰密切相关的一种必 需酶 抑制法尼基转移酶活性 阻止 Ras 蛋白的活化 可以有效地抑制肿瘤细 胞的增殖 代表药物 替匹法尼 3 肿瘤新生血管生成抑制药物 原理 原发肿瘤的生长和转移是依赖于新生血管生成的 开发和研究能够破坏或抑 制血管生成 有效地抑制肿瘤生长和转移的药物 称为 TA 抑制剂 是新型 抗肿瘤药物研究的活跃领域之一 4 代表药物 angiostatin 和 endostatin Avastin Endostatin 可直接与血管内皮细胞受体结合抑制内皮细胞的增生 x000B 可与肝素样的硫酸蛋白结合 抑制血管生成 x000B 可抑制 VEGF 等血 管生长因子 从而抑制内皮细胞的增殖 与肿瘤的生长 x000B 可抑制 抗凋亡蛋白 Bcl 2 Bcl x1 促使血管内皮细胞凋亡加速 4 肿瘤耐药逆转剂 原理 根据肿瘤耐药的特点可分为原药耐药 PDR 和多药耐药 MDR 两大类 前者只 对诱导药物产生耐药性而对其它药物不产生交叉耐药性 如抗代谢药甲氨蝶呤 MTX 5 氟尿嘧啶 5 Fu 等 后者则是指肿瘤细胞一旦对某种化疗药物产生耐 药性 同时对其它结构上无关 作用机制各异的药物也产生交叉耐药性 这是 一种独特的广谱耐药现象 许多天然来源的抗肿瘤药物如秋水仙碱 紫杉醇等 及蒽环类抗癌抗生素如阿霉素 柔红霉素都极易发生 MDR 肿瘤耐药产生的可能原因是药物代谢障碍 DNA 修复机制障碍 DNA 多聚酶 活性改变等 另外 耐药是凋亡抑制的表现 一些与凋亡抑制相关的癌基因 如 bcl 2 bcr abl NF KB 等 的表达产物可阻断或阻碍多种因素 如化疗药物 辐射 激素等 诱导的肿瘤细胞凋亡 产生耐药性 研究表明 MDR 的产生是由于细胞 内药物积聚发生障碍 此后研究证实细胞内药物积聚降低的同时 有一分子量 约为 170 000 细胞膜蛋白过度表达 称之为 P 糖蛋白 Pgp 代表药物 钙拮抗药 维拉帕米及其衍生物 钙调蛋白拮抗药 包括氯丙 嗪等吩噻嗪类衍生物 环孢素类 环孢素及其衍生物 PSC833 SDZ280 466 等 及抗雌激素类化合物 他莫昔芬 等 5 分化诱导剂 原理 通过诱导肿瘤细胞凋亡达到肿瘤缩小 消退的目的已成为当今肿瘤治疗的 研究热点 促进恶性细胞向成熟分化的抗癌药物称分化诱导剂 代表药物 维 A 酸类化合物 咪唑衍生物利阿唑 x000B 5 维 A 酸类化合物维甲酸类化合物 Retinoic acids 在调控细胞生长 分化 凋亡等 生命活动中起重要作用 其在体内的生理活性代谢产物包括全反式维甲酸 ATRA 13 顺维甲酸 13 cis RA 和 9 顺维甲酸 9 cis RA 它们可通过核维甲酸受体 RAR 结合于 DNA 应答元件 从而调节靶基因的转录 6 基因调节药物 a 反义药物 反义药物又称反义寡核苷酸药物 AODNs 是指人工合成长度为 10 30 个 碱 基的 DNA 分子及其类似物 根据核苷酸杂交原理 反义药物能与特定的 基 因杂交 在基因水平上干扰致病蛋白质的产生过程 AODNs 可以与其靶 RNA 链互补结合 形成 RNA DNA 杂交双链 形成的杂交双链可以被 RNA 酶 H 识别 并消化 RNA 链 由此释放出的 AODN 可以继续与靶 RNA 链结合 最终导致编 码基因沉默 由此可推 RNA 酶 H 过多表达可增强各种 AODNs 效应 反之 RNA 酶 H 受抑则降低其作用 有些 AODNs 并不能激活 RNA 酶 H 相反与翻译元件 竞争空间因此可抑制 RNA 翻译 另外 AODNs 如果和 mRNA 结合可作用于内 含子外显子接合处以中断其拼接过程 AODNs 还可以占领校正 RNA 细胞内定位 的蛋白 RNA 作用序列 从而扰乱 RNA 运输 药物 Vitravene b Decoy 核酸 6 Decoy 核酸是与靶转录因子具有高亲和性的双链寡聚核酸 通过竞争性抑制转录 因子与调控区域的结合 调控转录来改变下游基因的异常表达 从而抑制肿瘤恶 性增殖 体外筛选结合转录因子 AP2 的 decoy 核酸药物 结果 OG03 对多种肿瘤细胞 生长有显著的抑制作用 在异植人肿瘤细胞 NCI H460 的裸鼠模型中 静脉注射 高中低三剂量组的 decoy 核酸 OG03 抑瘤率分别达 71 8 64 4 及 57 3 通 过凝胶阻抑试验 验证了 OG03 与转录因子产生特异性结合 实验结果为 decoy 核酸转录调控药物的研究提供了依据 C RNA 干扰 RNA 干扰 RNAinterference RNAi 是由双链 RNA double stranded RNA dsRNA 引 发的转录后基因静默机制 RNAi 是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵 抑制 转座子活动 调控基因表达的监控机制 由于 RNA 干扰是针对转录后阶段的基 因沉默 相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除 整个流程设计更简便 且 作用迅速 效果明显 为基因治疗开辟了新的途径 其总体思路是通过加强关 键基因的 RNAi 机制 控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复 制及表达 7 单克隆抗体药物 单克隆抗体 单抗 药物就是通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备的抗体 起初用于诊断剂或检测剂 后来用于治疗肿瘤 病毒性感染 心血管病以及其 它疾病 治疗肿瘤的优越性 1 单抗药物对肿瘤细胞的选择性杀伤作用 7 2 单抗药物具有更高的疗效 3 单抗药物对肿瘤相关靶点的特异性作用 其研究重点主要集中在将抗体与化学药物 酶 放射性核素 毒素和生物诱 导剂等耦联后直接杀伤肿瘤或者利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生 成等方面 目前 国际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体与耦联 物作用后直接杀伤肿瘤细胞 利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成 等方面 代表药物 曲妥珠单抗 trastuzumab Herceptin Trastuzumab 为靶向结合 HER2 的人 IgG1 类单抗 HER2 为酪氨酸激酶受体 在约 20 25 的进展期乳腺癌患者过表达 HER2 分子具有以下的特点 因此 成为乳腺癌治疗的靶分子 HER2 的表达水平与乳腺癌的发病机理及预后相关 肿瘤的 HER2 表达水平及基因拷贝数远高于正常组织 有效的减轻了 HER2 靶向治疗药物的毒性 HER2 表达阳性的肿瘤细胞比例很高 而且在肿瘤细胞表面高表达 因此 在患者体内可以靶向大多数的肿瘤细胞 HER2 在原发肿瘤及转移灶均有表达 因此 HER2 靶向治疗对原发及转移病 灶均有效 曲妥珠单抗 trastuzumab 的作用机制 抑制受体信号传导 HER2 可以活化多种信号传导通路 包括 PI3K MAPK 等 Trastuzumab 减少了这些信号通路的传导 将细胞阻滞于调定点 诱导细胞凋亡 受体信号传导的降低是由于 trastuzumab 介导的 HER2 受体内化及降解 通过调节 p27kipl 阻滞细胞于 G1 调定点 Trastuzumab 处理的细胞被阻滞于 G1 调定点 细胞增殖减少 细胞阻滞于 G1 调定点与细胞周期依赖的激酶抑制 蛋白 p27kipl 相关 诱导细胞凋亡 体内研究表明 trastuzumab 可以诱导乳腺癌细胞凋亡 凋亡 的发生与 Ki67 的表达无关 8 抑制血管形成 高表达 HER2 的肿瘤细胞新生血管及 VEGF 的表达显著增加 体内研究结果显示 trastuzumab 处理后 乳腺癌肿瘤体积减小 微血管密度降 低 体外研究表明 trastuzumab 处理后 内皮细胞的迁移能力下降 抑制 DNA 修复 体外研究显示可与许多化疗药物产生协同效应 Trastuzumab 或联合化疗药物促进 DNA 损伤 并抑制 DNA 的修复 最终导致细 胞凋亡 三 抗肿瘤药物筛选及评价 以国立肿瘤研究所 Nationai Cancel Institute NCI 为代表的美国抗肿瘤药物筛 选模式经历了三个发展阶段 1955 1985 年 以动物移植性肿瘤为基本模型 以动物生命延长率和瘤重抑制 率为药物活性的基本评价指标 此阶段是以化合物为本位的体内筛选方法 1985 1990 年 NCI 提出并在广泛研究和试点的基础上逐渐完善以人肿瘤细胞 株为基础 疾病本位的体外抗肿瘤药物筛选模型 这阶段是新旧筛选模型并存 新的筛选体系逐渐取代旧筛选体系的过渡阶段 1990 至今 以人肿瘤细胞株为基础 疾病本位的体外抗肿瘤药物筛选体系 其目的在于发现对某种组织类型肿瘤活性强但可能对其他组织类型肿瘤活性弱 的化合物 在该体系中 样品先经过 9 大类 60 种人类肿瘤细胞株进行体外筛选 结果通过评估后 再进行裸鼠体内的人类肿瘤异种移植研究 国内抗肿瘤药物筛选和研究体系虽与 NCI 相似 但也形成了自己的特点 根据我国肿瘤发病情况 选择试验瘤株组成 主要选择白血病 肺癌 胃癌 结肠癌 肝癌 乳腺癌 卵巢癌等细胞株 相当一部分是细胞株是国内自己建 的 9 体外抗瘤谱试验选用了正常细胞株 综合考虑了受试样品对正常组织的毒性 选用了人肿瘤耐药细胞株 测试受试样品的耐药逆转作用和耐药细胞株增殖 的直接抑制作用 以期发现具有抗耐药作用的药物 选用人血管内皮细胞株进行同步体外试验 初步考察受试样品是否具有血管 生成抑制作用 抗肿瘤药的临床前药理研究包括药效学和毒性研究两部分 抗肿瘤药物药效学需研究内容 体外抗肿瘤试验 体内抗肿瘤试验 x000B 评价药物的抗癌活性时 以体内试验结果为主 同时参考体外试验结果以做出 正确的结论 四 体外抗肿瘤活性试验 目的 对候选化合物进行初步筛选 了解候选化合物的抗瘤谱 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考 如剂量范围 肿瘤类别等 体外试验常用方法有 1 染料排斥法 试验原理 活细胞有排斥某些染料如伊红 台盼蓝 苯胺黑等的能力 而死细 胞由于膜完整性的破坏 可被着色 因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料 一 定时间后 对着色和未着色的细胞进行计数 即可算出被杀死的细胞比例 方法要点 向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液 最常用的是 0 4 台盼蓝液 混匀 室温染色 5 15min 将已染色的细胞悬液滴加至血细胞计数 板 直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数 10 观测指标 按 未染色细胞数 细胞总数 X100 计算活细胞率 对照组活细胞 率应在 90 以上 根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量 IC50 作为药 物抗肿瘤活性的指标 2 四氮唑盐还原法 试验原理 四氮唑 MTT 3 4 5 dimethylibiazol 2 yl 2 5 diphenyl tetrazolium bromide 是一种能接受氢原子的染料 活细胞线粒体中与 NADP 相关的脱氢酶 在细胞内可将黄色的 MTT 转化成不溶性的蓝紫色的甲 月替 formazan 而死 的细胞则无此功能 用二甲基亚讽 DMSO 溶解甲 月替 后 在一定波长下用酶 标仪测定光密度值 即可定量测出细胞的存活率 方法要点 受试样品处理细胞结束后 加入 5mg ml MTT 液 20 微升 孔 继续 培养四小时 再加三联液并培养过夜 在酶标仪上于 570nm 波长处检测 OD 值 观测指标 直接指标为 96 孔板上各被测孔的 OD 值 然后按公式 对照组 OD 值 治疗组 OD 值 对照组 OD 值 100 计算出相应的细胞生长抑制率 剧情况 可进一步采用 Logit 法计算 50 生长抑制浓度 IC50 值 3 阿拉马蓝法 试验原理 非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内的 NADPH 相关 的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物 采用微培养板自动读数仪在激发与发 射波长分别为 530nm 和 590nm 处读取荧光强度值 与活细胞数呈良好的线性 关系 方法要点 细胞经受试样品处理后 加入 10 20ul 阿拉马蓝染液 继续培养一定 时间 用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为 530nm 和 590nm 处读 取荧光强度值 观测指标 根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率 适当时可进一步计算 IC50 值 4 磺酰罗丹明染色法 试验原理 SRB 是一种蛋白质结合染料 粉红色 可溶于水 SRB 可与生物大 分子中的碱性氨基酸结合 其在 515 nm 波长的 OD 读数与细胞数呈良好的线性 关系 故可用作细胞数的定量 MTT 法的一个缺点是 OD 值可随放置时间而变 而 SRB 法无此现象 因此更适用于进行大规模的试验 11 方法要点 用 10 冷三氯乙酸与 4 固定已经受试样品处理的细胞 1h 洗涤 干燥 加入 4mg ml SRB 液 100 微升 孔 染色 15min 1 冰醋酸洗涤 干燥 最 后加入 150 微升 孔 的 Tris 溶液 在酶标仪上与 515nm 波长处检测 OD 值 观测指标 同 MTT 法 另外 NCI 目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿瘤 活性 测定的 OD 值包括对照组 加药组及加药时的细胞的 OD 值 C T 和 T0 据此计算 生长抑制率 T T0 C T0 100 细胞死亡率 T T0 T0 100 按生长抑制率或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图 并求出 GI50 即生长抑制率为 50 时的样品浓度 TGI 即生长抑制率为 100 时的样品浓度 LC50 即细胞死亡率为 50 时的样品浓度 5 集落形成法 试验原理 克隆原细胞具有持续增殖能力 当单个细胞分裂 6 代或 6 代以上时 其后代所组成的群体 集落 便含 50 个以上细胞 通过集落计数可对克隆原细胞 作定量分析 它反映了单个细胞的增殖潜力 故能较灵敏地测定抗癌药的活性 日前被认为是一种较理想的检测方法 方法要点 将浓度为 500 个细胞 ml 的对数生长期细胞悬液 2ml 种至 35ml 的培 养皿 并加受试样品适量 培养 7d 或更长时间 姬姆萨染色 解剖显微镜下计 数含 50 细胞以上的集落 观测指标 根据集落数计算集落形成率 对照组集落形成率不应低于 40 再 计算用药组的集落形成抑制率 根据情况可进一步采用 Logit 法计算受试样品的 IC50 值 集落形成率 集落数 细胞接种数 X100 集落形成抑制率 1 用药组集落形成率 对照组集落形成率 X100 6 生长曲线测定法 试验原理 在最适条件下 肿瘤细胞在培养液中呈指数生长 如取细胞数的对 数与培养时间作图可得一条直线 故称此时为对数生长期 随着细胞密度不断 12 增高 由于代谢产物的积聚及营养物的消耗 细胞生长逐渐减慢以致停止 此 时称高坪期或稳定期 因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来 方法要点 将浓度为 10000 个细胞 ml 的对数生长期细胞悬液按每瓶 5ml 种至 25ml 的培养瓶 或按每孔 100 微升种至 96 孔板 并加受试样品适量 培养后 分别于即刻和 1 2 3 4 5 6 7d 进行检测 前者可采用台盼蓝染色计数活 细胞 后者可采用 MTT 法或 SRB 法读取 OD 值 并据此进行作图与计算 观测指标 1 倍增时间 TD 将实际生在曲线进行直线回归求出 0 和 t 时刻的理 论细胞数 N0 和 N t 据此计算 TD 0 301t log N t log N0 2 增殖细胞杀 伤率 N0 N0 N0 100 3 细胞生长饱和密度 N s 代表高坪期每 毫升细胞数的均数 药物与细胞共培养时间一般为 48 72 小时 贴壁细胞需先贴壁 24 小时后再给 药 试验应设阳性及阴性对照组 阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药 阴性 对照为溶媒对照 a 体外筛选方法的优点 操作简单 用药量少 取材可直接用于人体肿瘤 得出结果快速 b 体外筛选方法的缺陷 细胞毒性易显阳性 有毒物质也常常显阳性 故假阳性率高 非直接对肿瘤细胞作用的药物显示假阴性 体外细