掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变化

中国组织工程研究 第18卷 第3期 2014 01 15 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 15 2014 Vol 18 No 3 ISSN 2095 4344 CN 21 1581 R CODEN ZLKHAH 365 www CRTER org 彭红 女 1987 年生 湖 北省天门市人 汉族 2013 年四川大学毕业 硕 士 主要从事生物材料研 究 通讯作者 余喜讯 副教授 四川大学高分子科学与工 程学院 四川省成都市 610065 doi 10 3969 j issn 2095 4344 2014 03 006 http www crter org 中图分类号 R318 文献标识码 A 文章编号 2095 4344 2014 03 00365 06 稿件接受 2013 10 24 Peng Hong Master School of Polymer Science and Engineering Sichuan University Chengdu 610065 Sichuan Province China Corresponding author Yu Xi xun Associate professor School of Polymer Science and Engineering Sichuan University Chengdu 610065 Sichuan Province China Accepted 2013 10 24 掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞 行为和功能蛋白的变化 彭 红 顾志鹏 黄程程 徐源廷 余喜讯 四川大学高分子科学与工程学院 四川省成都市 610065 文章亮点 1 前期实验发现掺锶聚磷酸钙材料对于单独培养的内皮细胞和成骨细胞的行为有显著促进作用 文章的创新 在于首次从分子水平探讨掺锶聚磷酸钙对共培养下成骨细胞与脐静脉内皮细胞行为和功能蛋白表达的影响 2 文章的特点在于首次发现成骨肉瘤细胞与内皮细胞共培养于掺锶聚磷酸钙后 掺锶聚磷酸钙上调了细胞血 管内皮生长因子 碱性成纤维细胞生长因子蛋白水平的表达 今后将对血管初期成型方面进行进一步研究 使体系更完善 关键词 生物材料 骨生物材料 掺锶聚磷酸钙 内皮细胞与成骨细胞共培养体系 血管内皮生长因子 碱性成纤维 细胞生长因子 主题词 生物相容性材料 磷酸钙类 锶 内皮细胞 成骨细胞 摘要 背景 前期实验发现掺锶的聚磷酸钙材料对单独培养内皮细胞或成骨细胞的行为有显著促进作用 目的 观察掺锶聚磷酸钙对共培养下成骨细胞与脐静脉内皮细胞行为和功能蛋白表达的影响 方法 取第 3 代人脐静脉内皮细胞与人成骨肉瘤细胞 MG63 以 2 1 的浓度比接种于 24 孔板中 然后再分 别加入掺锶聚磷酸钙 聚磷酸钙与羟基磷灰石 共培养 7 d 后 采用 ELISA 法检测细胞血管内皮生长因子 碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达 采用 MTT 法检测细胞活性 结果与结论 与聚磷酸钙与羟基磷灰石相比 在掺锶聚磷酸钙表面生长的细胞呈现更加良好的形态 细胞融 合生长形成单层覆盖在材料表面 并且在材料表面有一定的跨度生长 说明掺锶聚磷酸钙材料能促进内皮细 胞在其上黏附 伸展 有利于细胞的生长和增殖 掺锶聚磷酸钙组细胞分泌的血管内皮生长因子 碱性成纤 维细胞生长因子明显高于聚磷酸钙组和羟基磷灰石组 P 0 05 说明掺锶聚磷酸钙可上调血管内皮生长因 子 碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达 彭红 顾志鹏 黄程程 徐源廷 余喜讯 掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞 行为和功能蛋白的变 化 J 中国组织工程研究 2014 18 3 365 370 Effects of strontium doped calcium polyphosphate on behavior and angiogenic growth factors expression of co cultured osteoblasts and endothelial cells Peng Hong Gu Zhi peng Huang Cheng cheng Xu Yuan ting Yu Xi xun School of Polymer Science and Engineering Sichuan University Chengdu 610065 Sichuan Province China Abstract BACKGROUND Our previous studies have shown that strontium doped calcium polyphosphate containing low dose strontium appears to have a significant effect on angiogenesis related behaviors of monocultured umbilical vein endothelial cells and osteoblasts OBJECTIVE To investigate the effect of strontium doped calcium polyphosphate on angiogenesis related behaviors of umbilical vein endothelial cells and osteoblasts co cultured including cell adhesion spreading proliferation as well as the protein secretion of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor from co culture system in vitro METHODS Human umbilical vein endothelial cells and osteoblastic cells MG63 were utilized in this study Cells from passage 3 were used for preparation of the cell scaffold constructs After placed in 24 well plate at a ratio of 2 1 human umbilical vein endothelial cells and MG63 cells were seeded onto strontium doped calcium polyphosphate calcium polyphosphate and hydroxyapatite scaffolds and co cultured for 7 days The vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor protein levels were determined through a double ligand enzyme linked immunosorbent assay The colorimetric 3 4 5 dimethylthiazol 2 yl 2 5 diphenyltetrazolium bromide assay was performed to quantify the effect of scaffolds on cell proliferation RESULTS AND CONCLUSION Compared with those on calcium polyphosphate and hydroxyapatite scaffolds cells on strontium doped calcium polyphosphate scaffolds attached and spread better with a significantly improved cell proliferation More importantly the vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor expressions were significantly higher in the strontium doped calcium polyphosphate group than the other two groups P 0 05 indicating strontium doped calcium polyphosphate can up regulate levels of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor proteins 彭红 等 掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞 行为和功能蛋白的变化 P O Box 10002 Shenyang 110180 www CRTER org 366 www CRTER org Subject headings biocompatible materials calcium phosphates strontium endothelial cells osteoblasts Peng H Gu ZP Huang CC Xu YT Yu XX Effects of strontium doped calcium polyphosphate on behavior and angiogenic growth factors expression of co cultured osteoblasts and endothelial cells Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu 2014 18 3 365 370 0 引言 Introduction 骨组织工程的目标是用来修复大面积骨骼缺损 骨修 复过程不仅是新骨的生长 还需要血循环重建 这样才能 为新生骨组织中的细胞提供养分 排泄废物 1 2 所以理想 的骨组织工程支架材料应该具有促血管化功能 在早期骨 折愈合过程中会出现缺损局部高能代谢状态 此时对血供 及能量物质的需求提高 3 5 因此在构建组织工程化骨组织 的同时 促进小血管的长入及细胞与材料复合物内血供的 重建就成为骨组织工程由基础向临床应用的关键性环节 6 血管生成主要受到血管化生长因子的影响 在所有己知的 血管化生成因子成员中 血管内皮生长因子是促血管生成 作用最为特异而确切的因子 其在生理和病理性血管生成 中都起着核心的调节作用 7 碱性成纤维细胞生长因子在 促血管生成过程中具有多效性特点 它是一种内源性多肽 生长因子 同时是另一种最有效的促进血管生成因子 它 通过提高成骨细胞的增殖和促进内皮细胞的生长来促进骨 形成和血管化 8 成骨细胞和内皮细胞在生长良好的状态 下都可以表达血管内皮生长因子 碱性成纤维细胞生长因 子 然而 在新骨生长过程中诱导快速血管化的困难性成 为骨组织工程应用于坏损组织更换的主要限制因素 9 10 Pacicca等 11 研究发现成骨细胞与内皮细胞共培养 成骨 细胞分泌的血管内皮生长因子量显著高于单一细胞组 同 时有血管样结构形成 Hofmann等 12 13 发现成骨细胞与内 皮细胞共培养于支架材料上能够生成血管样结构 共培养 的成骨和内皮细胞之间通过复杂的相互作用控制着骨形成 和血管化 14 将两种细胞在支架材料上共培养是解决骨组 织工程促血管化的一种有效途径 另一方面 支架材料在 骨组织工程的血管化方面也起着重要作用 如果生物材料 或组织工程支架材料自身具有诱导血管生成的生物活性 就可以刺激移植或迁移到支架材料上的细胞释放血管内皮 生长因子 碱性成纤维细胞生长因子 然后与成骨细胞和 内皮细胞的共培养体系相结合 将会增加在新骨生长过程 中诱导快速血管化的可能性 锶是一种具有促进骨形成和减少骨吸收双重作用的 骨组成元素 15 17 同时锶元素能有效提高材料的生物相 容性和生物活性 聚磷酸钙是一种具有优良机械性能和 生物相容性的生物陶瓷骨组织工程材料 在骨修复方面 受到广泛关注 18 19 前期实验发现掺锶聚磷酸钙材料对于单独培养的内 皮细胞和成骨细胞的行为有显著促进作用 20 21 实验在3 种不同支架材料掺锶聚磷酸钙 聚磷酸钙和羟基磷灰石 上将成骨细胞与内皮细胞以一定比例共培养 研究掺锶 聚磷酸钙支架材料对共培养体系的细胞行为和血管内 皮 生长因子 碱性成纤维细胞生长因子表达的影响及 机制 1 材料和方法 Materials and methods 设计 体外细胞学观察实验 时间及地点 于2011年7月至2012年7月在四川大学 完成 材料 细胞株 人脐静脉内皮细胞株HUVEC 由四川大学 华西医院移植工程与移植免疫实验室提供 人成骨肉瘤 MG63细胞株 由四川大学华西医院移植工程与移植免疫 实验室提供 实验方法 支架材料的制备 按锶 钙一定摩尔比例称取碳酸锶 碳酸钙 与磷酸溶液反应制备磷酸二氢盐 无水乙醇除去 多余磷酸 置混合盐于坩埚内 500 煅烧 升温使熔融 再淬火得到无定型烧料 研磨筛分烧料 取粉末与一定量 的致孔剂和黏合剂混合 压制成直径10 mm 高2 mm的 型胚 一定温度下烧结制得聚磷酸钙和含锶量为8 的掺 锶聚磷酸钙多孔支架 射线辐照灭菌后备用 内皮细胞和成骨样细胞的培养 将冻存的内皮细胞 HUVECs和人成骨肉瘤MG63细胞复苏 用含体积分数为 10 小牛血清 100 U mL青霉素 100 U mL链霉素的 RPMI1640培养液于37 体积分数为5 CO2的饱和湿 度下培养 隔天换液 取第3代细胞备用 细胞与支架材料的复合培养 在接种细胞前 将 射 线辐照灭菌后的掺锶聚磷酸钙 聚磷酸钙和羟基磷灰石支 架材料在RPMI 1640培养液中浸泡12 h 其中羟基磷灰石 和聚磷酸钙作为实验对照 将第3代两种细胞用0 25 胰 掺锶聚磷酸钙对共培养成骨细胞与内皮细胞影响实验的试剂与仪器 试剂与仪器来源 羟基磷灰石四川大学生物材料工程研究中心 碳酸锶 碳酸钙 磷酸分析纯 成都市科龙化工试剂厂 RPMI1640 培养基美国 Gibco 公司 小牛血清Hyclone 公司 MTT美国 Sigma 公司 MCO 18AIC 型 CO2 恒温培养箱日本三洋公司 酶联免疫检测仪美国 BIO RAD 公司 JSM 5900LV 扫描电子显微镜日本电子株式会社 ELISA 试剂盒R5 2983 2 Yu H VandeVord PJ Mao L et al Improved tissue engineered bone regeneration by endothelial cell mediated vascularization Biomaterials 2009 30 4 508 3 Leung KS Sber AH Lam TS et al Energy metabolism in fracture healing Measurement of adenosine triphosphate in callus to monitor progress J Bone Joint Surg 1989 71B 4 657 4 Barralet J Gbureck U Habibovic P et al Angiogenesis in calcium phosphate scaffolds by inorganic copper ion release Tissue Eng Part A 2009 15 7 1601 5 Yoshida T Kikuchi M Koyama Y et al Osteogenic activity of MG63 cells on bone like hydroxyapatite collagen nanocomposite sponges J Mater Sci Mater Med 2010 21 4 1263 6 Gorustovich AA Roether JA Boccaccini AR Effect of bioactive glasses on angiogenesis a review of in vitro and in vivo evidences Tissue Eng Part B Rev 2010 16 2 199 7 Hirschi KK D Amore PA Control of angiogenesis by the pericyte molecular mechanisms and significance EXS 1997 79 419 8 Bottcher RT Niehrs C Fibroblast growth factor signaling during early vertebrate development Endocrine Rev 2005 26 63 9 Kanczler JM Oreffo RO Osteogenesis and angiogenesis the potential for engineering bone Eur Cell Mater 2008 15 100 10 Lovett M Lee K Edwards A et al Vascularization strategies for tissue engineering Tissue Eng Part B Rev 2009 15 3 353 11 Pacicca DM Patel N Lee C et al Expression of angiogenic factors during distraction osteogenesis Bone 2003 33 889 12 Hofmann A Ritz U Verrier S et al The effect of human osteoblasts on proliferation and neo vessel formation of human umbilical vein endothelial cells in a long term 3D co culture on polyurethane scaffolds Biomaterials 2008 29 31 4217 13 Santos MI Unger RE Sousa RA et al Crosstalk between osteoblasts and endothelial cells co cultured on a polycaprolactone starch scaffold and the in vitro development of vascularization Biomaterials 2009 30 26 4407 14 Deb S Mandegaran R Di Silvio L A porous scaffold for bone tissue engineering 45S5 Bioglass derived porous scaffolds for co culturing osteoblasts and endothelial cells J Mater Sci Mater Med 2010 21 3 893 15 Zhang WB Shen YH Pan HB et al Effects of strontium in modifi ed biomaterials Acta Biomater 2011 7 800 16 Xie H Wang Q Ye Q et al Application of K Sr co doped calcium polyphosphate bioceramic as scaffolds for bone substitutes J Mater Sci Mater Med 2012 23 4 1033 17 Zreiqat H Ramaswamy Y Wu C et al The incorporation of strontium and zinc into a calcium silicon ceramic for bone tissue engineering Biomaterials 2010 31 12 3175 18 Qianbin W Qiguang W Changxiu W The effect of porosity on the structure and properties of calcium polyphosphate bioceramics Ceramics Silik ty 2011 55 1 43 19 Qianbin W Qiguang W Changxiu W Effect of sintering time on the microstructure and properties of inorganic polyphosphate bioceramics Science Sintering 2010 42 337 20 Liu F Zhang X Yu XX et al In vitro study in stimulating the secretion of angiogenic growth factors of strontium doped calcium polyphosphate for bone tissue engineering J Mater Sci Mater Med 2011 22 683 21 余喜讯 顾志鹏 任大伟 等 新型骨科材料SCPP 对成骨细胞促 血管化生长因子表达影响的研究 J 四川大学学报 2011 43 1 219 22 Soker S Machado M Atala A Systems for therapeutic angiogenesis in tissue engineering World J Urol 2000 18 10 23 Zhang J Hu M Zhang WY Influence of vascular cell co cultured with osteoblast in vitro on ability of osteoblast Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi 2005 23 325 24 Boden SD Bioactive factor for bone tissue engineering Clin Orthop Rel