壁虎不同提取工艺成分抗肿瘤作用的研究

1 / 7壁虎不同提取工艺成分抗肿瘤作用的研究作者：李钦青，孙明江，代龙，孔令提【摘要】 目的比较壁虎不同提取工艺成分对 S180和 H22 荷瘤小鼠的抑瘤作用及免疫器官的影响。方法以肉瘤 S180、肝癌 H22 荷瘤小鼠作为动物模型，以抑瘤率及胸腺、脾脏指数为指标比较壁虎原粉及水煎煮、胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、仿生酶解等不同工艺成分的抗肿瘤作用。结果 3 种酶解工艺成分对肉瘤 S180 和 H22 肝癌抑瘤率均明显高于原粉与水煎煮液，相比模型组有显著性差异(P 【关键词】 壁虎; 酶解; 抗肿瘤; S180; H22壁虎，别名守宫、壁虎、蝎虎、天龙，味咸性寒，功能祛风，定惊，散结，解毒。壁虎作为药材始见于本草经集注 ，而本草纲目就称其能治“瘰疬初起血积成痞，反胃膈气，痈疮大痛” 。 其可入血分透筋达络，既善破血散结解毒，又能通经活络而止痛。随着壁虎多种药理活性，特别是抗肿瘤活性被发现后1， 人们对壁虎的关注度日益提高。目前壁虎临床一般以原粉、水煎煮等方法应用，存在服用量大、易被微生物污染等缺点。现代药理研究表明，动物类药材发挥作用的主要为其小分子肽24，因此，我们拟采用酶解方法得到其小分子肽，并与常规原粉和水煎煮液比较其抗肿瘤作用的差异。2 / 71 材料动物昆明种小鼠，雄性，体质量(202)g，购自山东中医药大学实验动物中心，动物许可证号为：SCXK(鲁)XX0015。S180 腹水小鼠和 H22 肝癌小鼠均购自山东省医学科学院。仪器 JJ-2 型组织捣碎机，江苏江南仪器厂;摇摆式高速中药粉碎机，浙江大德中药器械有限公司;W-O 型恒温水浴锅,上海申顺生物科技有限公司，TDL-5 飞鸽牌离心机，上海安亭科学仪器厂;小型切向流超滤系统，美国Millipore 公司(密理博)。试剂及药品胃蛋白酶(酶活力1 200 U/g)，胰蛋白酶(酪蛋白转化力)，均购自国药基团化学试剂有限公司，注射用环磷酰胺，200 mg/支，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：08051354，氟尿嘧啶注射液(5-Fu)，上海旭东海普药业有限公司，批号:080302。壁虎购自济南兴旺蟾业，经本校周风琴教授鉴定系壁虎科动物无蹼壁虎 Gekko swinhonis Gunther 的干燥全体，置干燥箱 60以下真空干燥，粉碎，过 80 目筛，细粉备用。2 方法供试品溶液的制备原粉液的制备取壁虎细粉，用%羧甲基纤维素将其稀释成 1 ml g 的混悬液，备用。3 / 7水煎煮提取液的制备取壁虎细粉，加 8 倍量水煮沸煮沸 60 min，离心，残渣加 8 倍量水煮沸 30 min，离心，合并上清液，浓缩至 1:(每毫升药液相当于 g 药材，下同)，即得水煎煮提取液。胃蛋白酶酶解液的制备5取壁虎细粉 90 g，置于组织捣碎器中，加入 5 倍量水，匀浆(10 000 r/min)10 min，等分为 3 份，取 1 份，煮沸 15 min，放冷，调节 pH ，移至 37 恒温水浴锅中，保温 10 min，加入 1%胃蛋白酶，2 h 后取出，离心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微滤( m)，超滤(相对分子质量 3 000)，收集相对分子质量小于 3 000 部分，浓缩至 1，即得胃蛋白酶酶解液。胰蛋白酶酶解液的制备6取“”项下一份样品液，煮沸 15 min，放冷，调节 pH ，移至 55 恒温水浴锅中，保温 10 min，加入 1%胰蛋白酶，3 h 后取出，离心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微滤( m)，超滤(相对分子质量 3 000)，收集相对分子质量小于 3 000 部分，浓缩至1，即得胰蛋白酶酶解液。 仿生酶解液的制备取“”项下一份样品液，煮沸 15 min，放冷，调节 pH ，移至 37 恒温水浴锅中，保温 10 min，加入 1%胃蛋白酶，2 h 后取出，调节 pH ，移至 55 恒温水浴锅中，保温 10 min，加入 1%胰蛋白酶，3 h 后4 / 7取出，离心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微滤( m)，超滤(相对分子质量 3 000)，收集相对分子质量小于 3 000部分，浓缩至 1，即得仿生酶解液。抗肿瘤作用的比较7对 S180 荷瘤小鼠的影响无菌抽取传代 8 d 的 S180腹水小鼠腹腔肿瘤细胞，加入生理盐水调整浓度至 4109个/L，于每只小鼠右腋下注射 ml，接种 140 只。接种 24 h 后，将小鼠随机分为 7 组，每组 20 只，即模型组、原粉组、水煎煮组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、仿生酶解组与阳性对照组。模型组灌胃生理盐水 10 mlkg-1，连续 10 d;原粉组、水煎煮组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、仿生酶解组均 5 g 药材kg-1 药液，连续 10 d;阳性对照组腹腔注射环磷酰胺，剂量 30 mgkg-1，连续 3 d;给药量均为 10 mlkg-1。第 11 天，各组动物颈椎脱臼处死，剥离肿瘤、胸腺、脾脏，称重，计算抑瘤率、胸腺与脾脏指数，计算公式如下：抑瘤率(%)=(空白组瘤重均值-样品组瘤重均值)/空白组瘤重均值100%胸腺(脾脏)指数=重量(mg)/体质量(g)对 H22 荷瘤小鼠的影响建模方法、给药方式、剂量均同 S180 荷瘤小鼠(对照组为 5-Fu，25 mgkg-1)。统计学方法实验数据采用 SPSS 统计软件进行分析，5 / 7所有测定数值以s 表示，采用方差分析法进行分析，P 3 结果对 S180 荷瘤小鼠的影响对 S180 荷瘤小鼠抑瘤率的影响结果见表 1 表 1 对S180 荷瘤小鼠抑瘤作用的影响对 S180 荷瘤小鼠脾脏、胸腺指数的影响结果见表2 表 2 对 S180 荷瘤小鼠免疫器官的影响对 H22 荷瘤小鼠的影响对 H22 荷瘤小鼠抑瘤率的影响结果见表 3 表 3 对H22 荷瘤小鼠抑瘤作用的影响对 H22 荷瘤小鼠脾脏、胸腺指数的影响结果见表 4表 4 对 H22 荷瘤小鼠免疫器官的影响4 讨论壁虎在临床上常用于肿瘤，特别是消化道肿瘤的治疗，一般焙干研细或水煎煮入药，但壁虎起抗肿瘤作用的物质基础还不清楚。小分子肽抗肿瘤作用逐渐引起了人们的注意。越来越多的研究表明，动、植物含有小分子肽具有很好的抗肿瘤作用，世界上许多国家正在竞相研究开发小分子肽类抗肿瘤的防治药物，如谷胱甘肽、海参五肽、槲寄生肽、胸腺五肽等8，9。本研究运用酶解的方式，使壁虎含有的蛋白类成分酶解成小分子肽，对其抗肿瘤作用进行研究。研究结果表明，壁虎经酶解后的抗肿瘤作用6 / 7明显高于原粉组与水煎煮组。本实验中的壁虎仿生酶解是指模拟人体消化过程，先用胃蛋白酶酶解，再以胰蛋白酶酶解的方法，对壁虎药材进行酶解。小分子肽的界限划分迄今未有明确定义，鉴于国内外热门研究小分子肽的相对分子质量都在 3 000 以下10，本实验中 3 种酶解液均为经过超滤所得的相对分子质量小于 3 000 的小分子肽。6 黄开华，周艳明，吴 畏，等.胰蛋白酶酶解鹿血条件的优化J.湖北农业科学，XX，46(2):302.7 徐叔云.药理学实验方法学M.北京：人民卫生出版社，2001:1270