枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶发酵培养基的研究

枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶液体发酵培养基优化及条件的研究 通过单因素实验在摇瓶条件下对枯草芽胞杆菌产碱性蛋白酶的 液体培养基进行优化 确定了最佳碳源为糊精 进一步在 5L 的发酵 罐上进行发酵并对发酵过程进行控制得到以下结论 枯草芽孢杆菌 产碱性蛋白酶为生长相关型发酵类型 生长周期为 38h 发酵到 36h 时酶活达到最大 酶活最大值为 433U mL 此时 pH 为 8 35 OD600 为 1 158 可以用 pH 是否超过 8 来当作发酵终点的表 观特征 1 材料与设备 1 菌株 枯草芽孢杆菌 2 材料与试剂 福林试剂 三氯乙酸 0 4mol L 碳酸钠溶液 0 4mol L 干酪素 溶液 10g L 氢氧化钠溶液 0 5mol L 蔗糖 乳糖 葡萄糖 糊精 可溶性淀粉 柠檬酸钠 磷酸氢二钾 无水氯化钙 3 仪器与设备 恒温水浴锅 分光光度计 5 升发酵罐 离心机 试管 吸管 滤 纸 酸度计 高压灭菌锅 超净工作台 恒温摇床 4 培养基 基本培养基 胰蛋白胨 5g L 柠檬酸钠 3 g L 磷酸氢二钾 10 g L 氯化钙 3 g L 种子培养基 胰蛋白胨 5g L 酵母粉 5 g L 葡萄糖 10 g L 磷酸氢 二钾 18 g L 发酵培养基 酵母粉 2g L 胰蛋白胨 3 g L 糊精 50 g L 柠檬酸钠 3g L 磷酸氢二钾 10 g L 氯化钙 3 g L 配培养基时水用自来水 2 方法 1 酶活测定 2 标准曲线制备 表 1 不同酪氨酸浓度下的吸光值 A680 管号酪氨酸 浓度 ug L 酪氨 酸使用 ml 水 ml0 4mol L Na2CO3 吸光 值 A680 0 1 2 3 4 5 0 10 20 30 40 50 0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 5 5 5 5 5 5 根据表 1 以酪氨酸浓度为纵坐标 吸光值 A680 横坐标 绘制标准 曲线 由绘制出的曲线进行线性回归得线性方程 令 x 1 算出 y 值 即得到吸光常数 K 的值 酶活测定公式 计算酶活公式如下 样品的酶活力 U ml A680 n k 4 10 式中 A 为样品平行实验的平均吸光度 K 为吸光常数取 96 54 4 为反应试剂的总体积 ml 10 为反应时间 min n 为稀释倍数 酶活力单位定义为 在温度 55 pH10 0 条件下 1min 水解酪素产 生 1 g 酪氨酸所需酶量定义为 1 个酶活力单位 以 U 表示 3 摇瓶条件确定最佳碳源 3 1 配制碳源分别为不同唯一碳源的培养基 在 150mL 的三角瓶中 装 25mL 并在 121 下高压灭菌 20min 3 2 以接种量为 4 进行无菌接种 3 3 在摇床中 37 下培养 48h 转速为 160r min pH 为自然 3 4 把样品稀释成 10 倍和 50 倍 在 12000r min 离心 15min 取上清 液测定酶活 3 5 以酶活为指示确定最佳碳源 4 发酵罐过程控制 160 r min 37 恒温振荡培养 12 h 制备种子液 采用 5 L 发酵罐 接种量为 2 5 发酵罐中的装液量为 60 进行恒溶氧变温发酵 并在发酵开始 12h 时开始过程控制 每隔 2 h 取样 并记录温度 转速 溶氧 发酵液在 2 000 r min 离心 15 min 取上清测定发酵 液的 OD600 pH 值 A680 并采用福林法测定蛋白酶活力 3 结果与分析 1 碱性蛋白酶活力测定的标准曲线制备 2 不同碳源对芽孢杆菌产碱性蛋白