基因测序

产品培训 赵婷,产品流程及入院流程,什么是基因？,基因是遗传的物质基础，最少构成生命需要382个基因，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。也通过突变改变这自身的缔合特性，储存着生命孕育、生长、凋亡过程的全部信息，通过复制、表达、修复，突变，完成生命繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程。生物体的生、长、病、老、死等一切生命现象都与基因有关。它也是决定生命健康的内在因素。,DNA转录翻译.swf,基因检测就是提取血液中的DNA样品，根据不同的疾病易感基因和药物不良反应的不同要求，分别采用DNA测序或SNP基因分型技术共同完成检测。基因检测使人们能及时了解自己的基因信息，了解身体患疾病的风险，预防疾病的发生。,BaiO,关注基因 改善健康,什么是基因检测？,未来医院疾病诊断的核心,基因检测,预知疾病、提前保健,药物创新利用、疾病得到治愈，医疗水平得到提升,个体化用药、更加有效，避免风险,BaiO,关注基因 改善健康,基因检测的意义,早在20世纪50年代，人们就发现不同的遗传背景会导致药物反应的差异，而这些差异是由基因多态性造成的基因组中每500-1000bp就有1个呈现变异，但是直到20世纪80年代这些差异才引入药物遗传学。人们发现了许多具有基因多态性的酶，在此基础上建立了药物基因组学。,BaiO,关注基因 改善健康,药物基因组学的诞生,是研究基因序列多态性与药物效应多样性之间关系，即基因本身及其突变体与药物效应相互关系的一门科学。,药物基因组学是以药物效应及安全性为目标，研究各种基因变异与药效及安全性。药物基因组学的重点并不是疾病发生的内在分子机理，而是个体遗传差异对药物反应的不同作用，因此，药物基因组学着重于遗传差异（即基因多态性）的快速测定的关系。,BaiO,关注基因 改善健康,药物基因组学的定义,根据药物基因组学的原理，为特定人群设计最为有效的药物提高疗效缩短病程减少毒副反应降低治疗成本,药物基因组学的目的-正确药物、正确剂量,药物基因组学的目标-“价廉物美”,运用遗传信息进行个性化用药，将正确药物、正确剂量在恰当的时间给予合适的患者。,BaiO,关注基因 改善健康,药物基因组学的目标,BaiO,关注基因 改善健康,药物相关的基因大致可分为四类编码基因：,1）药物代谢相关的酶,2）药物结合相关的受体,3）药物转运相关的膜通道,4）信号传导相关的蛋白质,诊断性基因检测 多数用于有症状单基因疾病诊断 单基因疾病症状出现前的诊断预测性基因检测 多数用于多基因常见疾病的遗传风险预测 个体化用药基因检测 用于指导临床药物治疗,BaiO,关注基因 改善健康,BaiO,基因检测的分类,临床可用于药物代谢酶（CYP）基因多态性检测的技术主要有三种：DNA测序技术（DNA sequence）基因芯片技术（gene microarray）实时定量PCR技术（Real time PCR，RT-PCR）,BaiO,关注基因 改善健康,BaiO,基因检测技术,基因芯片（Gene Chip）通常指DNA芯片，其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片的概念现已泛化到生物芯片（biochip）、微阵列（Microarray）、DNA芯片（DNA chip），甚至蛋白芯片。,2001年，成功研制国际上第一张针对具体疾病的“高血压个体 化用药基因芯片”。2004年，成立个体化用药指导咨询中心2006年，成立个体化治疗遗传分析中心2009年9月，国内第一张个体化用药指导基因检测产品批文获批，弥补了中国个体化用药基因检测市场的空白。2010年，成立中南大学湘雅医学检验所2012年，召开个体化用药前沿研讨会,BaiO,关注基因 改善健康,BaiO,基因检测技术在中国的发展,1998年，美国推出新药“赫赛汀”，标志着个体化用药时代的来临。1999年4月19日，美国首次提出以遗传为导向的个体化用药.2003年，美国FDA颁布行业指南草案：药物基因组学数据报送，2005年3 月22 日正式颁布。2005年美国FDA批准第一个个体化用药基因检测产品上市，个体化用药 基因型检测的序幕正式被拉开。,据美国FDA统计表明，近年来，化学新药的获批比例在逐年下降，而与个体化用药有关的基因检测产品的获批比例却在逐年提高。美国FDA已经成立了专门机构研究指导基因与用药的相关政策，奥巴马政府也已把“个体化治疗”作为美国医疗改革的重要内容。,BaiO,关注基因 改善健康,个体化用药里程碑性事件,FDA在100多种药物说明书中给予基因信息提示,/Drugs/ScienceResearch/ResearchAreas/Pharmacogenetics/ucm083378.htm,FDA已批准多款个体化用药基因检测产品,国内已有个体化用药基因检测产品获批,636 (*3),父亲,母亲,681 (*2),*1/*1 型：父亲和母亲遗传给我们的CYP2C19基因，*2和*3位点都没有发生突变，对药物的代谢速度快。,636 (*3),父亲,母亲,681 (*2),*1/*2 型：表明父亲或母亲其中有一个人遗传给我们的CYP2C19基因的*2位点发生了突变，对药物的代谢速度中等。,636 (*3),父亲,母亲,681 (*2),*1/*3 型：表明父亲或母亲其中有一个人遗传给我们的CYP2C19基因的*3位点发生了突变，对药物的代谢速度中等。,636 (*3),父亲,母亲,681 (*2),*2/*2 型：表明父亲和母亲遗传给我们的CYP2C19基因，*2位点都发生了突变，对药物的代谢速度慢。,636 (*3),父亲,母亲,681 (*2),*3/*3 型：表明父亲和母亲遗传给我们的CYP2C19基因，*3位点都发生了突变，对药物的代谢速度慢。,636 (*3),父亲,母亲,681 (*2),*2/*3 型：表明父亲和母亲遗传给我们的CYP2C19基因，一个*2位点发生了突变，一个*3位点发生了突变，对药物的代谢速度慢。,636 (*3),681 (*2),636 (*3),681 (*2),*1/*1,*1/*2,*1/*3,*2/*2,*3/*3,*2/*3,*1/*1野生型，快代谢。 *1/*2、*1/*3一个位点突变，中代谢。,二个位点突变，慢代谢。,第一节,CYP2C19基因检测试剂主要应用于抗抑郁药，抗癫痫药，肿瘤药，质子泵抑制剂等。目前重点应用于抗血小板聚集治疗药物氯吡格雷的个体化给药，提高药物疗效，减少毒副反应或无效用药情况的发生,CYP2C19参与约20多种药物的代谢,CYP2C19在氯吡格雷代谢中发挥重要作用,氯吡格雷是前体药物，85%经酯酶代谢为无活性的产物。15%经两步代谢为活性产物，发挥抗血小板的作用。参与代谢的有CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP3A5。,体内活性代谢产物因CYP2C19基因突变减少32.4%,CYP2C19突变，导致体内活性代谢产物减少32.4%。与快代谢患者相比，突变患者发生心血管疾病、急性心梗、中风导致的死亡风险为1.53倍(12.1% vs. 8.0%，95%CI，1.07-2.19，P=0.01)。与快代谢患者相比，突变患者发生支架内血栓的风险为3.09倍（2.6% vs. 0.8%，95%CI，1.19-8.00，P=0.02）。受CYP2C9、2B6、1A2、3A5影响无显著差异。,N Engl J Med 2009(360);4 :354-62,CYP2C19基因突变导致不良心血管事件风险增高,不良心血管事件：死亡、心肌梗死、缺血性中风,里程碑式研究：ELEVATE-TIMI 56试验,JAMA, 2011;306(20):2221-2228,多中心，随机对照，双盲试验，研究增加剂量（up to 300mg）对CYP2C19突变患者血小板聚集抑制的改善情况。,结论：CYP2C19 *1/*2型患者，维持剂量增加至225mg，其对血小板活性的抑制程度方可达到*1/*1型患者的水平。而对于*2/*2型患者，即使维持剂量增加至300mg，仍然难以达到相当的血小板抑制水平。,*1/*1,*1/*2,*2/*2,2010年，FDA在氯吡格雷说明书中给予黑框警告,波立维主要依赖于CYP2C19代谢生成活性代谢产物，发挥抗血小板疗效。常规剂量的波立维在CYP2C19弱代谢型患者，体内活性代谢物生成减少，抑制血小板聚集功能下降。弱代谢型的ACS或接受PCI治疗的患者，常规剂量波立维治疗下心血管事件率较正常代谢型患者上升。CYP2C19基因型是可以检测的，检测结果可作为医生调整治疗策略的参考标准。对于CYP2C19弱代谢型患者，建议考虑调整治疗方法或治疗策略。,2011年ESC、ACC 更新应用指南加入基因诊断内容,2011版ESC指南，第20页,2011版ACC指南，第11页,两大顶级心脏病学会时隔4年再次更新临床应用指南。与07版指南相比，在抗血小板治疗方面，欧洲心脏病学会（ESC）和美国心脏病学会（ACC）都加入了基因诊断项目，且把这个更新都归为b类指导建议（即为可考虑使用的建议类型）。可以看出，两大学会对于基因分型检测在抗血小板治疗中起到的作用持肯定态度且都给予了重视。,I 类：获益远远大于风险；II a/b类：获益远大于风险；III类：无获益或有害。,2011年中文版氯吡格雷说明书做出相应修订,慢代谢基因型的分布频率白人约2%，黑人约4%，中国人约14%，现存检测患者CYP2C19基因型的方法。,卫生部北京医院药学部建议CYP2C19基因检测,中国循证医学杂志 2012, 12(9): 1063-1070,文献报道的解决方案,SA Scott, K Sangkuhl, EE Gardner, et al. Clinical Pharmacology 56:32141,CYP2C19检测报告单,该患者CYP2C19基因型为*3/*3，代谢速度慢。,第二节,对硝酸甘油的正确使用作出指导，降低无效风险评估待检者的酒精代谢解毒能力和疾病易感风险,ALDH2-乙醛脱氢酶2,ALDH2基因突变患者服用硝酸甘油无效的风险很高,NO,ALDH2,扩血管,ALDH2基因突变者对乙醇代谢不畅，对身体伤害大,ALDH2*1/*2或ALDH2*2/*2突变基因携带者是许多临床疾病的高危人群,乙醇 乙醛 乙酸 水、二氧化碳,ALDH2,ALDH2检测报告单,该标本ALDH2基因型为Glu504Glu，可用硝酸甘油，对酒精解毒能力好,第三节,CYP2C9：细胞色素P450 （药物代谢酶家族） CYP2C9VKORC1：维生素K环氧化物还原酶根据基因检测结果可以指导医生正确给出华法林初始用药剂量，大幅降低华法林个体差异造成的不良反应，保障用药安全。,华法林处方量大，不良反应多,华法林（warfarin）:香豆素类，长期口服抗凝血药，抑制维生素K依赖性凝血因子的活化起到抗凝作用。是FDA药物不良反应检测系统最常报告的药物之一。治疗和预防： 心房颤动和心脏瓣膜病所致血栓； 心脏瓣膜修复术； 防止髋关节手术静脉血栓； 预防复发性血栓栓塞心房颤动（心率紊乱）。,治疗窗窄、个体差异大，剂量很难把握,治疗窗窄，有效治疗浓度2.20.4 g/mL；个体化差异大（比如：起始剂量给予3-5mg/天，而达到INR2.0-3.0所需的稳定剂量可能1-20mg /天）；药物起效和失效缓慢，需要频繁调整药物剂量 凝血酶原时间（PT）和国际标准化比值（INR），大大阻碍了华法林临床使用的易用性；,确定华法林剂量需要数周时间，而不良事件高发期在30-60天！,中国人对华法林的抗凝作用更为敏感,运用华法林抗凝治疗的同时，也成倍地增加了患者出血的发生率，甚至是危及生命，尤其是在治疗初期的数周到数月内。据估计，服用华法林的患者中，每年每100人中，平均有15.2人次发生出血副作用，其中致命性的大出血有3.5人次。,使用华法林的另一个特点是其稳定剂量在不同种族间及个体间存在着较大差异。与欧洲人相比，中国人对华法林的抗凝作用更为敏感，所需的稳定剂量比欧洲人要低40-50，而不同个体间稳定剂量的差异可达20倍以上。,FDA 2007年修订华法林说明书,在说明书警示部分标明CYP2C9和VKORC1遗传差异影响华法林的抗凝作用。并建议在使用华法林治疗前进行CYP2C9和VKORC1基因检测。,FDA 2010年在华法林说明书中增加起始剂量选择表,国际华法林药物基因组学联合会（IWPC）剂量公式,国际华法林药物基因组学联合会（The International Warfarin Pharmaeogenetics Consortium）共搜集5700例使用华法林治疗的病人（其中包括华人在内的亚洲人1634例），通过大量数据，制订了华法林的剂量运算法，结果显示，它明显优于传统的固定剂量方案。,1, White (White+Caucasian+Hispanic)2, Black or African American3, Asian (Japanese,Han Chinese, Chinese, Korean, Malay, Indian)4, Others (Other Mixed Race+Intermediate),（IWPC）剂量公式取值方法,UKPMC Funders Group, N Engl J Med. 2009, 360(8): 753764.,IWPC剂量公式公益网站,IWPC还发布了单机版的excel计算表,华法林基因检测报告单,该标本CYP2C9基因型为*1/*3型，VKORC1基因型为AA型,第四节,一、可指导孕妇个体化叶酸补充方案，降低缺陷新生儿出生率 二、C677T基因多态性与高同型半胱氨酸血症(HCY)发生密切相关三、C677T基因多态性与部分肿瘤科药物疗效相关，可指导与MTHFR基 因相关肿瘤科药物的个体化用药。,（亚甲基四氢叶酸还原酶）,MTHFR是叶酸代谢途径的关键酶,MTHFR：亚甲基四氢叶酸还原酶，生成5-甲基四氢叶酸,MTHFR 677CT突变导致叶酸代谢障碍,MTHFR 677CT,丙氨酸(Ala) 缬氨酸,产生一个HinfI和TaqI限制性酶切位,酶活性&热稳定,叶酸代谢障碍,叶酸缺乏导致出生缺陷和血液异常凝固的风险增高,膳食中叶酸补充不足,叶酸缺乏,MTHFR基因突变导致叶酸利用能力不足,高同型半胱氨酸血症,血液异常凝固,新生儿缺陷,脑卒中,冠心病,静脉血栓,神经管缺陷,唐氏综合征,唇腭裂,妊娠高血压,习惯性流产,携带MTHFR 677T突变基因的孕妇生育婴儿患出生缺陷的风险显著升高,MTHFR 677T基因型携带者出现凝血倾向的风险显著升高,未来叶酸个体化补充模式,CC型孕妇：只需按推荐剂量每日补充400ug叶酸即可，同时注意膳食中的叶酸摄取。CT型尤其是TT型孕妇：建议每日补充600-800ug叶酸，此外还应加强膳食中叶酸的摄取。对于已生育过出生缺陷儿童的孕妇，在孕前和孕早期需要每日补充4000ug，也就是4mg叶酸（常规量的10倍），具体遵医嘱。叶酸摄入不宜过量，长期过量服用（每日超过1000ug），会干扰孕妇的锌代谢，同样会影响胎儿发育。还可能引起体内的B12缺乏，导致胎儿神经系统受损。 中国营养学会编写的中国居民膳食营养素参考摄入量， 美国疾病控制预防中心（CDC）建议。,叶酸基因检测报告单,该标本MTHFR基因型为CT型。,DNA提取,试剂分类,PCR扩增,杂交,杂交和识读仪外观,产品流程及入院流程,由于百傲自动杂交仪和基因检测盒的操作流程前期必须完成：DNA提取和PCR扩增。需主体操作的科室具备DNA提取和PCR扩增的基本设备。,如果该科室不具备DNA提取和PCR扩增的设备和技术，那么我们需要协助该科室添置PCR仪等相关设备，全套设备购买费用最低约3.5万元。所有DNA提取和PCR扩增所需设备，详见实验设备配置清单。,除了上述的相关基础设备要求外，相对管理严格的区域，医院需要具备该省临检中心批准的“PCR检测中心”的资质。如该医院目前无此项资质，如是二级以上医院可进行该项资质的申报，各省临检中心是此项资质的审核及验收单位，省临检中心是省卫生厅直属管理的单位。,基因检测产品入院前提条件,所有医院的开发进院，我们需要：确定“两个科室”，解决“四步关键问题”。,两个科室 四步关键问题,两个科室,四步关