微生物讲稿

化验基础知识,玻璃仪器的洗涤及使用 药物分析对实验仪器的清洁度要求较高，若仪器不干净，在分析中引入污物，会影响测定结果的准确度和精密度。所以，仪器的洗涤是分析工作中的重要步骤，必须重视，对所用的玻璃仪器，一般要求洗净至不挂水珠。 1、洗涤剂及其使用范围 最常用的洗涤剂有肥皂、洗衣粉、洗洁精、洗液及有机溶剂等。,化验基础知识,肥皂、洗衣粉、去污粉等一般用于可以用刷子直接刷洗的仪器，如锥形瓶、烧杯、试剂瓶等。 洗液多用于不便于用刷子洗刷的仪器，如滴定管、移液管、容量瓶、比色管、玻璃垂熔漏斗、凯氏烧瓶等特殊要求与形状的仪器。 有机溶剂，如氯仿、乙醚、乙醇、丙酮、甲苯、汽油等可用于油脂性污物较多的仪器。 2、洗液的配制与使用,化验基础知识,（1）重铬酸钾洗液的配制与使用 配制：称取重铬酸钾150g，加水300ml溶解，再加硫酸3000ml。 使用：将要洗的玻璃仪器用常水冲洗干净，并尽量将水空干，再加入洗液洗涤。 注意事项：尽量避免水分混入，防止其稀释逐渐降低洗涤效力，新配制的洗液为红褐色，氧化能力很强，洗液可反复使用，使用过久水分混入太多，便会减弱洗涤能力，当用至洗液由棕色变为绿色时，即推失去了洗涤作用。,化验基础知识,（2）醇制氢氧化钾的配制 取氢氧化钾100g，溶于50ml的水中，放冷后加乙醇稀释成1000ml，即得，本液用于洗涤油腻或有机物，洗涤效果较好。 3、玻璃仪器的洗涤与要求 一般的玻璃仪器先用自来水冲洗干净，然后用适当的洗涤剂洗涤，再用自来水冲洗干净，最后用纯化水或注射用水冲洗三次。 洗净的玻璃仪器应不沾油腻，不挂水珠。,化验基础知识,4、玻璃仪器的使用 （1）滴定管：装滴定液前的滴定管洗净至管内不挂水珠，自然沥干，先用少量滴定液荡洗3次（每次约5到10ml）。 滴定液装入滴定和应超过标线零以上，滴定管尖端的气泡必须排尽。滴定管装满溶液后，管外壁的溶液应擦干，把滴定管垂直固定于滴架上，尽量避免手持滴定管。 使用酸式滴定管时，活塞向右，在转动活塞,化验基础知识,时，应向左扣住，以防止顶出活塞。 每次滴定应从零刻度开始，在装满溶液后，滴定前初读零点，静置1到2分钟，若零点无变动，方能滴定。 滴定速度不宜太快，以每秒3到4滴为宜，成滴不成线，滴定近终点时，应一滴一滴逐滴加入，滴至终点后，需等1到2分钟，待附着在内壁的溶液全部流下后再读数。 读数时应注意视线与液面处于同一水平面上，否则会引起读数误差。,化验基础知识,滴定管有无色和棕色两种，对需避光的滴定液，如：硝酸银滴定液、亚硝酸钠滴定液及高锰酸钾滴定液等用棕色滴定管。 （2）容量瓶 ：使用前，应先检查容量瓶瓶塞是否密合，空容量瓶洗净后应自然晾干，不应在烘箱中烘烤。 若要将固体物质配制一定体积的溶液，通常将固体物质称量在小烧杯中，用水溶解后，再定量的转移到容量瓶中，残留在烧杯中的，用少量水洗3到4次，洗涤液转移到容量瓶中；若,化验基础知识,固体物质是易溶的，且溶解时没有大量放热效应，可将溶质通过漏斗直接称量至容量瓶中。若是浓溶液稀释，则用移液管吸取一定体积的浓溶液，放入容量瓶中，溶液转至容量瓶中后，加水稀释至约四分之三体积时，将容量瓶平摇几次，作初步混匀，然后继续加水，近标线时小心地逐滴加入，直至溶液的弯面与标线相切。盖紧塞子，摇匀。 （3）移液管：移液管为精密量取一定体积时用。,化验基础知识,使用前应洗净，自然沥干。 先吸入移液管容量的三分之一左右，取出横持，并转动管子使溶液接触到刻度以上的部位，然后将溶液从管的下口放出并弃去，如此淋洗2到3次。将管插入供试品溶液面下约1cm，吸取溶液至刻度线以上，立即用右手食指按住管口。取出移液管，用滤纸拭干移液管下端外壁，并使之与地面垂直，轻轻放松食指，使管内溶液慢慢从下口流出，直至溶液的弯面底部与标线相切为止。用食指压紧管口，,化验基础知识,将尖端的液滴靠壁去掉。将移液管移入接受溶液的容器中，使容器倾斜，移液管保持直立，管下端紧靠容器内壁，放松食指，使溶液顺壁自动全部流出，约等15秒，取出移液管。,分析天平的使用与称量,一、简述 1、分析天平的感量为0.1mg、0.01mg、0.001mg，用于比较精密的检验工作中称量，如药品的含量测定，对照品的称量，滴定液的标化，微量水分的测定等。 2、以杆杠为原理构成的天平为机械天平，以电磁力平衡原理，直接显示质量读数的天平为电子天平。二、天平室的要求,化验基础知识,1、天平室应靠近实验室，便于操作，并防止气流和磁场干扰。 2、天平室要求干燥明亮，光线均匀柔和，阳光不得直射在天平 上。 3、为便于天平的保养和保持环境的相对湿度，感量为0.001mg的天平，应单室放置。 4、天平室的地面不得起灰，墙壁和屋顶平整，不得有脱落物。 5、天平台用混凝土结构为好，台面应水平,化验基础知识,而光滑，一般用水磨石；牢固防震，有合适的高度与宽度。 6、天平室温度应相对稳定，一般应控制在10 到30 ，保持恒温，相对湿度一般在65%以下，室内应备有温度计和湿度计，一般采用空调和吸湿机调节温度和湿度，并保持天平内外温度和湿度趋于一致。 7、天平室电源要求相对稳定，电压变化小。 8、天平室内除存放与称量有关的物品外，,化验基础知识,不得存放其他物品，不得在天平室内转移具有腐蚀性或挥发性的液体和固体。 三、天平的使用 1、使用前的准备 （1）、根据称取物质的量和称量精度的要求，选择适宜精度的天平。要求精密称定时，当取样量大于100mg，选用感量为0.1mg的天平，在100至10mg选用感量为0.01mg的天平，小于10mg选用感量为0.001mg的天平。,化验基础知识,（2）、选择好适宜的天平后，在使用天平前，应检查该天平的使用记录，了解天平前一次使用情况以及天平是否处于正常可用状态。并检查水准器内的气泡是否位于水准器圆的中心位置，否则应予调节使天平处于水平状态。 （3）、如天平处于正常可用状态，必要时用软毛刷将天平盘上的灰尘轻刷干净。 （4）、称量前，应先调好零点。 （5）、称量时使用的器皿，应根据称量需要选用大小适宜的称量瓶或三角瓶。,化验基础知识,2、使用 （1）、接通电源，打开电源开关和天平开关，预热至少30分钟以上。也可于上班时预热至下班关断电源，使长期处于预热状态。 （2）、调整零点，天平预热后，按操作规程调整零点，一般电子天平均装用自动调零钮，轻轻按动即可自动调零。 四、称量操作方法 1、减量法,化验基础知识,（1）、将供试品放于称量瓶中，置于天平盘上，称量为W1 ，然后取出所需的供试品量，再称剩余供试品和称量瓶重量为W2 ，两次称量之差，即为W1 -W2 ，为称取供试品重量。（2）、使用电子分析天平，打开天平后显示0.0000时，在称盘上放入盛有供试品的称量瓶，记录重量W1 ，取下称量瓶，取出所需供试品量后，再放入称盘，记录重W2，W1 -W2即得称取供试品重量。,化验基础知识,（3）、减量法称量能够连续取若干份供试品，节省称量时间。 2、增量法 （1）、将称量瓶置于天平盘上，称量为W1将需称量的供试品加入称量瓶中，再称量为W2，两次重量之差，即W2- W1为称取供试品重量。 （2）、使用电子分析天平，打开天平后显示0.0000时，在称盘上放入称量瓶，称重为W1,化验基础知识,如需除去称量瓶重，可按一下控制板回零。将需称量的供试品直接置入称量瓶中，记录供试品与称量瓶重量W2， W2- W1即为称取供试品重量；如消除称量瓶重量后再称重，则显示的数值即为称取供试品重量。 （3）、需称取准确重量的供试品，常采用增量法。五、注意事项 1、天平室空调的冷气/暖气，不宜直接吹入天,化验基础知识,平室，应由天花板隔离进风。 2、分析天平不要放置在空调器下边的台上。搬动过的分析天平必须校正好水平，并对天平的计量性能全面检查无误后才可使用。 3、开启或关闭天平的动作应轻缓仔细。不能动作过大。 4、称量时，不要开动和使用前门，以防呼吸出的热量、水汽和二氧化碳及气流影响称量。取、放被称物体时，可使用两侧门，关门,化验基础知识,时，应轻缓。 5、称取吸湿性、挥发性或腐蚀性物品时，应将称量瓶盖紧后称量，且尽量快速，注意不要将被称物，（特别是腐蚀性物品）洒落在称盘或底板上；称量完毕，被称物及时带离天平室。 6、同一个试验应在同一台天平上进行称量，以免由称量产生误差，称量完毕，及时将所称供试品从天平内取出，关好天平门。 7、电子分析天平不能称量有磁性或带静电,化验基础知识,的物体。 六、分析天平的维护与保养 1、分析天平应按计量部门规定定期检定，并有专人保管，负责维护保养。 2、经常保护天平内部清洁，必要时用软毛刷或绸布抹净或用无水乙醇擦净。 3、称量时不得超过天平的最大载荷，天平内应放置干燥剂，常用变色硅胶，应定期及时更换。,化验基础知识,pH测定法一、简述 pH值的概念 溶液的酸碱度常用pH值表示，水虽然不是电解质，但也能电离。当水解离时，生成氢离子和氢氧根离子。 水解离时，每公升纯水中含有0.000 0001g的氢离子，由于氢离子浓度很小，用氢离子浓度表示溶液的酸碱度很不方便，为此，通常用氢离子浓度的负对数表示pH值，pH值就水溶液中氢离子浓度的负对数，以公式表示为：,化验基础知识,pH=-lgH+=lg(1/H+)。式中的氢离子浓度严格讲应以氢离子活度aH+表示，但是测定pH时，一般均为稀溶液，其活度系数近似于1，故H+ 和aH+也近似。为了方便起见，就用H+ 来表示。要注意的是一切pH测定方法所得的结果皆为“有效浓度”，而不代表总浓度。在25时，水溶液的pH值=7时为中性，小于7时为酸性，大于7时为碱性。每1L溶液中有1mol氢离子时， pH=0；每1L溶液中有1mol氢氧根离子时， pH=14,化验基础知识,pH测定法是测定溶液中氢离子活度的一种方法。pH值即水溶液中氢离子活度（以每1000ml中摩尔数计算）的负对数，pH=-lgaH+。实际测定中并不能测得单个氢离子的活度，只能是一个近似的数值，目前广泛应用的pH标度是pH的实际值。它是以实验为基础的，其定义为：,化验基础知识,pH=pHs+(E-ES)/k E与ES分别为电池中含有供试液与标准液时测得的电动势。 pHs为标准的已知pH值。K为每改变一个pH单位时的电位变化值。测定pH值时需选择适宜的对氢离子敏感的电极与参比电极组成电池，常用的对氢离子敏感的电极（简称指示电极）有pH玻璃电极、氢电极、醌-氢醌电极与锑电极等；参比电极有甘,化验基础知识,汞电极、银-氯化银电极等。最常用的电极为玻璃电极与饱和甘汞电极。现已广泛使用将指示电极与参比电极组合一体的复合电极。 pH值测定法各国药典均有收载。除另有规定外，水溶液的pH值以玻璃电极为指示电极、饱和甘汞电极为参比电极的不低于0.01级的酸度计进行测定。,化验基础知识,二、仪器与性能测试 酸度计是专为应用玻璃电极测定pH值而设计的一种电子电位计，基于由溶液与电极组成的电池电动势与pH值的关系，即在25时，电池电动势每变化0.059V相当于pH值变化一个单位。酸度计主要由pH测量电池（由一对电极与溶液组成）和pH指示器（电位计）两部分组成。玻璃电极的电位随溶液中的氢离子浓度而发生变化，称为指示电极；甘汞电极为参比电极，具有稳定的已知电位，作为,化验基础知识,测定时的标准。 玻璃电极在一支厚玻璃管下端接一个特殊材料玻璃球膜，其下端薄膜的厚度约为0.2mm，球中装有已知pH值的缓冲液，并有一个电极电位已知的参比电极（常用氯化银）作为内参比，电极的导线绝缘电阻必须大于玻璃膜电阻103以上，否则引起漏电，使读数不稳。甘汞电极是由汞、甘汞糊和氯化钾溶液组成。电极电位随氯化钾浓度不同可分为三种，即饱和甘汞电极，1mol/L甘汞电极与0.1mol/L,化验基础知识,甘汞电极。它们的电极电位各不相同，而且受温度影响，特别是饱和甘汞电极受影响最大，但由于制备简单，目前仍是最实用的参比电极。 最早酸度计的测定部分是用补偿式电位差计，现已淘汰不用，其后曾采用电子管电压表直接测定。现多数使用晶体管电路，不仅体积小，精度也有很大提高，有的智能化程度已很高，如除用高阻转换电路以外，还使用测温电路 、数模转换电路以及单板微机。测定功,化验基础知识,能多、精度高，能自动补偿、显示斜率与被测溶液的温度等。有的还能自动进行数据处理和打印数据。 根据中华人民共和国计量规程JJG119-84“实验室pH（酸度）计检定规程”，酸度计属于实行强制检定的计量器具。应每年进行检定。该规程收载有0.2、0.1、0.02、0.01、0.001共5个级别的pH计检定项目、检定要求和方法，标准缓冲液的配制、保存及其规定的pH值等内容。检定项目除示值准确度和重复性、用规,化验基础知识,定的3-5种标准缓冲液反复测定以外，其他项目如指示器刻度正确性、温度补偿刻度正确性、输入阻抗误差等的检定均用标准电位计测定。,化验基础知识,三、基本原理 玻璃电极的电位E玻与溶液中H+活度的关系符合Nernst方程式： E玻=k+(2.303RT/F)lgaH = k -（2.303RT/F)PH （1） 式中k为常数，称为电极常数；R为气体常数；T为绝对温度；F为法拉第常数； aH为溶液中H+的活度。,化验基础知识,温度25时 E玻=k -0.059 PH （2） 从式（1）中可知，在一定的条件下， E玻和pH有线性关系。式中2.303RT/F为E-pH曲线的斜率，称为转换系数（S），表示每改变一个单位时电极电位的改变。在使用过程中，玻璃电极会逐渐老化，S值可能偏离理论值，,化验基础知识,此时应对电极和斜率进行校正。 测定pH时，玻璃电极、待测溶液和指示电极如饱和甘汞电极（SCE）组成原电池，即： （-）玻璃电级（待测溶液）SCE（+） 电池电动势为 =Esce-E玻 =Esce- k +0.059 PH,化验基础知识,-(Esce- k )pH= (3) 0. 059 由(3)式可知，若已知Esce、 k ，则可由测得的电池电动势算出溶液的pH值。由于k 往往是未知的，而且因电极的不同而有差异，因此在测定前需用一已知pH值的标准缓冲液对仪器进行定位，即将电极插入 pH 值已知的,化验基础知识,标准缓冲液中，调节酸度计的定位钮，使读数恰好为标准缓冲液的pH值。相当于测定了Esce- k 的值。 电极的电位和温度有关，所以测定时应调节仪器的温度钮，将温度设定为待测溶液的温度。饱和甘汞电极在标准缓冲液和待测溶液中产生的液接电位不一定相同，二者之差称为残余液接电位，其值不易知道，但只要两种溶液的pH值比较接近，残余液接电位引起的误差,化验基础知识,可以忽略， 所以定位时选用的标准缓冲液的pH值应尽可能与待测溶液的pH值接近。四、测定方法 1、由于各酸度计的精度与操作方法有所不同，应严格按仪器说明书与注意事项进行操作，并遵从下列规范。 2、测定前，按各品种项下的规定，选择,化验基础知识,两种标准缓冲液（ pH值相差约三个单位），使供试液的pH值处于两者之间。 3、开机通电预热数分钟，调节零点与温度补偿（有的可能不需调零），选择与供试液pH值较接近的标准缓冲液进行校正（定位），使仪器读数与标示pH值一致；再用另一种标准缓冲液进行核对，误差应不大于正负0.02 pH单位，如大于此偏差，则应仔细检查电极，如已损坏，应更换；否则，应调节斜率，,化验基础知识,使仪器读数与第二种标准缓冲液的标示pH值相符合。重复上述定位与核对操作，直到不需要调节仪器，读数与两标准缓冲液的标示pH值相差不大于0.02pH单位。 4、按规定取样或制备样品，置小烧杯中，用纯化水充分洗涤电极，然后将水吸干，将电极浸入供试液中，轻摇供试液平衡稳定后，进行读数。对弱缓冲液（如水）的测定要特别注意，先用邻苯二甲酸氢钾标准缓冲液校正,化验基础知识,仪器后，更换供试液进行测定，并重新取供试液再测，直至pH值的读数在一分钟内改变不超过 0.05单位为止；然后再用硼砂标准缓冲液校正仪器，再如上法测定；二次pH值的读数应不超过0.1 ，取二次pH读数的平均值为其pH值。 5、当pH值不需很精确时，可使用pH试纸或指示剂进行粗略比较。,化验基础知识,五、注意事项 1、配制标准缓冲液与供试液的水，应是新沸放冷除去二氧化碳的注射用水或纯化水(pH值5.5至7.0 ），并应尽快使用，以免二氧化碳重新溶入，造成测定误差。 2、标准缓冲液最好是新鲜配制，在抗化学腐蚀、密闭的容器中一般可保存2到3个月，如发现混浊、发霉或沉淀等现象，不能继续使用。,化验基础知识,3、测定高pH值的供试液时，应注意碱误差的影响。因为当供试液的pH值大于9时，普通电极对钠也有响应，使测得的pH值高于真实值。使用锂玻璃制成的电极，可克服碱误差的影响。有些电极反应速度比较慢，尤其测定某些弱电解质（如水）时，必须将供试液轻摇均匀，平衡后再进行读数。 4、仪器读数开关、玻璃电极的导线插头与电极架均应保持干燥，潮湿易引起漏电，接触不良易使读数不稳。,化验基础知识,5、注意操作环境温度，温度对电极的电位影响较大，温度补偿调节钮的紧固螺丝是经过校准的，切勿使其松动，否则应重新校准。 6、新玻璃电极应在水中浸泡24小时后再用，以稳定其不对称电位，降低电阻，玻璃电极球泡中的缓冲液不应有气泡，应与内参比电极接触。在电极架上应高于甘汞电极，以免触及容器。甘汞电极中应充满饱和氯化钾溶液，不得有气泡隔断溶液，盐桥中应保持有少量氯,化验基础知识,化钾晶体，但不可结块堵塞陶瓷渗出孔。 7、玻璃电极的球膜极易破损，切勿触及硬物。有时破损后从外观辨别不出来，可用放大镜仔细观察，或用不同的缓冲液核对其电极响应。有时虽未破损，但玻璃膜内的溶液发生混浊，电极响应值不符合要求，即不可再用。 8、每次更换标准缓冲液或供试液之前，均应用水或该溶液充分淋洗电极，然后用滤纸吸干，再将电极浸入该溶液中进行测定。,化验基础知识,旋光度测定法一、基本原理 平面偏振光通过某些光学活性物质（如具有不对称碳原子的化合物）的溶液或液体时，偏振光的振动平面向左或向右旋转的现象称为旋光现象。偏振光旋转的角度称为旋光度。旋光度有左、右之分，偏振光向右旋转（顺时针方向）称为“右旋”，用“+”表示；偏振光向左旋转（逆时针方向）称为“左旋”，用“-”表示。偏,化验基础知识,振光透过长1dm且每1ml含旋光物质1g的溶液，在一定的波长和温度下测得的旋光度称为比旋度。比旋度是旋光物质的重要物理常数，可以用来区别药物或检查药物的纯杂的程度，也可以用来测定含量。 旋光度和测定的温度以及偏振光的波长有关。中国药典规定，除另有规定外，测定的温度为20，使用钠光的D线（589.3nm)作光源，在此条件下测定的比旋光度记为aD,化验基础知识,测定药物的比旋度时，取供试液，测定旋光度，按下式计算比旋度。 对液体供试品 aD=a/ld 对固体供试品 aD=100a/cl 式中， aD比旋度；a测得的旋光度；l测定管的长度，dm；d液体的相对密度；C供试品溶液的浓度，g/100ml。 如果已知比旋度，根据测得的旋光度计算药物,化验基础知识,的含量，则按下式计算。 C=100a/ aDL二、测定方法 （一）仪器旋光计：中国药典规定，应使用读数为0.01并经过检定的旋光计。旋光计的检定 用标准的石英旋光管进行，读数误差应符合规定。,化验基础知识,（二）测定中国药典旋光度测定法主要用于某些药品性状项下比旋度的测定，还用含量及杂质检查中的应用。 1、比旋度的测定 按各品种项下的规定进行操作。除另有规定外，供试液的测定温度为200.5，使用波长589.3nm的钠D线。纯液体样品测定时以干燥的空白测定管校正仪器零点。溶液样品则用空白溶剂校正仪器零点。供试液与空白溶剂用,化验基础知识,同一测定管，每一次测定应保持测定管方向、位置不变，旋光度读数应重复3次，取其平均值，按规定公式计算结果。以干燥品（药品中检查干燥失重）或无水物（药品标准中检查水分）计算。 2、含量的测定 按各品种项下的规定进行操作，配制样品浓度尽量与要求一致，其它的同上。 3、杂质检查中的应用。,化验基础知识,三、注意事项 （一）通电开机之前应取出仪器样品室内的物品，各示数开关应置于规定位置。先用交流供电使钠光灯预热启辉，启辉后光源稳定约20分钟后再进行测定，读数时应转换至直流电。不读数时间如果较长，可置于交流供电，以延长钠光灯的寿命。连续使用时，仪器不宜经常开关。有的仪器测定波长可调，除钠光灯外，还装有其他光源，如汞灯氙灯、钨灯等，可按操作说明书进行操作。,化验基础知识,（二）、温度对物质的旋光度有一定影响，测定时应注意环境温度，必要时，应对供试液进行恒温处理后再进行测定。 （三）、测定应使用规定的溶剂。每次测定前应以溶剂作空白校正，测定后，再校正一次，以确定在测定时零点有无变动；如第二次校正时发现零点有变动，则应重新测定旋光度。供试液如不澄清，应滤清后再用；加入测定管时，应先用供试液冲洗数次；如有气泡，应使用其浮于测定管凸颈处；旋紧测试管,化验基础知识,螺帽时，用力不要过大，以免产生应力，造成误差；两端的玻璃窗应用滤纸擦拭干净。 （四）、测定管不可置干燥箱中加热干燥，因为玻璃管与两端的金属螺帽的线膨胀系数不同，加热易造成损坏，用后可晾干或用乙醇等有机溶剂处理后晾干。注意，使用酸碱溶剂或有机溶剂时，必须立刻洗涤晾干，以免造成金属腐蚀或使螺帽内的橡胶垫圈老化、变粘。仪器不用时，样品室内可放置硅胶以保持干燥。,化验基础知识,（五） 按规定或根据读数精度配制浓度适当的供试品溶液，通常是读数误差小于1.0%。如供试品溶解度小，应尽量使用2dm的长测定管，以提高旋光度，减小测定误差。供试液配制后应及时测定，对于已知易发生消旋或变旋的供试品，应注意严格操作与测定时间。 （六） 物质的比旋度与测定光源、测定波长、溶剂、浓度和温度等因素有关。因此，表示物质的比旋度时应注意测定条件。,微生物学基础知识,一、什么是微生物？ 微生物是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。它们是一些个体微小 ，构造简单的低等生物。包括属于原核类的细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体和蓝细菌；属于真核类的真菌、原生动物和显微藻类；以及属于非细胞类的病毒、类病毒和朊病毒等。二、微生物的五大共性,微生物学基础知识,(1)体积小面积大 （2）吸收多转化快（3）生长旺繁殖快（4）适应强易变异（5）分布广种类多三、微生物的营养和培养基 营养是指生物体从外部环境摄取其生命活动所必须的能量和物质，以满足其生长和繁殖的需要。微生物有六种营养要素，即碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。熟悉微生物的营养知识，有了营养理论，就能更自觉和,微生物学基础知识,有目的地选用或设计符合微生物生理要求或有利于生产实践应用的培养基。培养基是一种人工配置的适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。因此任何培养基都应具备微生物所需要的六大要素，且其间的比例是合适的。 选用和设计培养基的原则： （1）目的明确 要明确培养基 的目的。要培养何菌？获何产物？用于大规模的发酵生产？作生产中的种子，还是用于实验室某个实验？等等。,微生物学基础知识,用于大规模生产上，则用作“种子”的培养基一般其营养成分丰富些，尤其氮源的含量较高（C/N比低）而用作大量生产代谢产物的发酵培养基则从整体上讲，它的氮源含量宜比“种子”培养基稍低（C/N比高）。 （2）营养协调 在大多数异养菌的培养基中，各营养要素间在量上的比例大体是符合十倍序列的递减规律，要素：水 C+能源N源P、SK、Mg生长因子。,微生物学基础知识,（3）物理化学条件适宜 各大类微生物一般都有它们合适的生长pH范围。细菌最适pH在7.0-8.0间，放线菌在7.5-8.5间，酵母菌在3.8-6.0间，而霉菌在4.0-5.8间。由于在微生物生长繁殖过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，尤其是不少的微生物有很强的产酸能力，若不适当地加以调节，就会抑制甚至杀死其自身，因而在设计它们的培养基时，就要考虑到培养基的pH调节能力。（一种是采用磷酸盐缓冲液的方式，一,微生物学基础知识,种是加入碳酸钙作“备用碱”的方式）四、影响微生物生长的主要因素 除前面讲过的营养条件外还有许多物理条件，最主要的温度、PH 和氧气。由于微生物的生命活动是有一系列生物化学反应组成的，而这些反应受温度的影响极为明显。任何微生物的生长温度尽管有宽有窄，但总有最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度这3个重要 指标。,微生物学基础知识,五、有害微生物的控制 控制有害微生物主要有杀灭（灭菌和消毒）和抑制（防腐和化疗），采用强烈的理化因素使任何物体内外部一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。灭菌实质上可分为杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但菌体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化，消失的现象。消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的,微生物学基础知识,措施。 六、物理杀菌的种类 有高温、辐射、超声波和激光，最常用的是高温。高温的致死作用，主要是由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性，破坏。它可使核酸发生脱氨，脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。七、我们常用的灭菌消毒的方法,微生物学基础知识,（1）干热灭菌法 包括火焰灼烧法和烘箱类热空气灭菌法 将金属制品或清洁玻璃皿放入电热烘箱内，在150-170度下维持1-2小时后，就可达到彻底灭菌的目的。在这种条件下，可使细胞膜破坏，蛋白质变性，原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。 (2) 湿热灭菌法 常压下有巴氏消毒法、煮沸消毒法和间歇灭,微生物学基础知识,菌法 巴氏消毒法是一种低温消毒法，其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌而又不影响客观存在的风味。具体的处理温度和时间各有不同，一般在60-85度下处理15秒到30分钟。 加压下分常规加压灭菌法和连续加压灭菌法 常规加压灭菌法其原理十分简单：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅内把锅内的水加热煮沸并把其中原有的空气驱尽,微生物学基础知识,后 将锅密闭。再继续加热就是锅内的蒸汽逐渐上升，从而温度升到100度以上。为达到良好的灭菌效果。一般要求温度应达到121摄氏度，时间维持15-20分钟，也可采用在较低的温度115摄氏度下维持35分钟的方法。 湿热灭菌比干热灭菌效果更有效 ，是由于湿热易于传递热量，湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。多数细菌和真菌的营养细胞在60度左右处理5-10分钟皆可杀死，细菌的芽孢要在120度下处理15,微生物学基础知识,分钟 才能杀死。 八、影响加压蒸汽灭菌效果的因素 （1）灭菌物体含菌量的影响 （2）灭菌锅内空气排除程度的影响 （3）灭菌对象pH 的影响：灭菌对象的pH6.0-8.0时，微生物较不易死亡，pH6.0 时，最易引起死亡。 （4）灭菌对象的体积：灭菌对象的体积大小对灭菌效果的影响甚为明显。因此在实验,微生物学基础知识,时，要防止用常规的压力和时间在加压灭菌锅内进行大容量培养基的灭菌。 （5）加热与散热速度,药品微生物学检验,药品微生物学检验 药品微生物学检验包括无菌检查、微生物限度检查、药物抗菌作用的测定等。在此主要介绍一下无菌检查法、微生物限度检查法。 无菌检查是检查要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。事实上，若供试品符合无菌检查的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。,药品微生物学检验,一、 无菌检查的环境 无菌检查环境应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气区域内或者是隔离区域内进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度认证。,药品微生物学检验,无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度应控制在1826，相对湿度45%65%。缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其它适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。,药品微生物学检验,二、 培养基制备 按照使用说明书进行配制 注意事项：（1）制备后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖 （2）制备好的培养基应放在阴凉处（2-25度），防止污染 （3）若保存在非密闭容器中有效期21天，在密闭容器中一般可保存一年；用水浴加热或微波炉 （4）培养基不能反复加热(玫瑰红钠反复,药品微生物学检验,加热有沉淀，霉菌培养基反复加热有白色颗粒） （5）供试品接种前培养基氧化层深度不能超过培养基深度的五分之一，否则须经100摄氏度水浴加热至粉红色消失。 培养基的无菌检查：将已备妥的每批培养基随机取不少于5瓶。按其用途分别置于30-35度23-28度培养箱培养14天，应无菌生长。,药品微生物学检验,培养基的灵敏度检查：取装量12ml的细菌培养基9管分别接入菌液100cfu/ml的金葡，枯草，铜绿假单胞菌，生孢梭菌各2管，一支为空白对照，放入35度培养箱培养3天；取9ml装量的改良马丁培养基5管，分别接入小于100cfu/ml的白色念珠菌和黑曲霉各2管，其中一支做空白对照 ，放入25度培养箱培养5天。不加菌的空白对照管无菌生长，加菌液的培养管生长良好，则判定培养基灵敏度符合规定。,药品微生物学检验,三、 无菌检查方法验证 目的：进行方法验证以确认供试品在所采用的检验条件下无抑菌作用，以保证所污染的微生物能充分检出，若药品的组分或原检验条件发生改变时，检测方法应该重新验证，以确保检查方法科学，合理，检验结果准确可靠。 无菌检查实验验证的基本方法生长比较法,与供试品无菌检查操作同样条件下，在2种培养基中，分别加入各标准菌株的应用菌液,药品微生物学检验,附：供试菌液制备：,10ml营养肉汤培养1618小时,9ml,9ml,1ml,1ml,10-1,10-2,取1接种环菌苔,药品微生物学检验,续供试菌液制备：,9ml,1ml,1ml,10-,10-,9ml,1ml,1ml,10-,10-,平均菌落数,820,79,6,9ml,9ml,药品微生物学检验,（100cfu/ml）,及规定量的供试品，同时在另一组相同培养基中加入标准菌株的应用液，不加供试品作为对照。两组同时培养3-5天，观察结果。比较2组各菌株生长情况，与对照管比较，如含供试品管中的实验菌生长良好，则该供试品可按该法进行无菌检查，若含供试品的任意一管中微生物生长微弱，缓慢或不生长，则该供试品在该检验条件下，具有抑菌作用，须经减除抑菌作用后重新进行,药品微生物学检验,验证。 四、无菌检查法 无菌检查法有薄膜过滤法、直接接种法两种方式。细菌培养温度32.52.5，真菌培养温度25.52.5. 薄膜过滤法用滤膜孔径为不大于0.45um，直径约为50mm。应根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质 如抑菌性供试品采用低吸附性的滤膜、油性,药品微生物学检验,供试品选用疏水性滤膜。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。同时每片滤膜的总过滤量不宜太大，以避免滤膜上的微生物受损伤。 薄膜过滤法的操作 打开带检样品的吕盖，取出培养器，先检查包装是否完好无损，将培养器逐个插放在不锈钢座上，把培养器的弹性软管装入集菌仪泵头，注意定位准确，软,药品微生物学检验,管走势顺畅。将培养器导管上的针头插到供试液容器塞上。开启电控集菌仪电源，将样品倒置固定于支架上，使药液均匀通过集菌培养器，待药液排尽，关闭电源，将针头取下，插至装有适宜冲洗液的瓶塞内，冲洗集菌培养器的滤膜，冲洗次数与冲洗量与验证实验保持一致。滤干，关闭电源。将集菌培养器的排气孔上帽取下，集菌培养器底部的排液口拧上，将冲洗液瓶取下换上相应的培养基，启动电源，把培养基泵入指定的培养器内，关闭电源。用,药品微生物学检验,夹夹闭与培养器连接的软管，将软管端套在空气过滤器开口上，将细菌培养基、真菌培养基及阳性对照培养基分别加入薄膜过滤器内；如果供试品无抗菌作用，则不用冲洗滤膜。 无菌检查均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，做阴性对照。阴性对照不得有细菌生长。 无菌检查每次操作时，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，做阴性对照。阴性对照不得有细菌生长。,药品微生物学检验,将已操作完毕的含培养基的集菌培养器移出无菌室，取其中一管作为阳性对照，依阳性对照菌选择原则加入相应的对照菌液。按规定的时间、温度培养。 6.培养与观察 培养期间应逐日观察是否有菌生长，填写检查记录表。若加入供试品后，或在培养过程中培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观,药品微生物学检验,上判定无微生物生长，可取该培养液适量接种于同种新鲜培养基中或斜面上，继续培养。细菌培养48小时，真菌培养72小时，观察是否再混浊或斜面上有无菌生长；或用接种环取培养液涂片，染色，镜检，进行判断。 7、结果判定 若供试品管均澄清，或虽显混浊但均确证无菌生长，判断供试品符合规定；若供试品任何一管显混浊，并确定有菌生长，判供试品不,药品微生物学检验,符合规定，除非能充分证明试验结果无效即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判定试验结果无效： （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控不符合无菌检查法的要求； （2）回顾无菌检查试验过程中，发现有可能引起微生物污染的因素。 （3）阴性对照管有菌生长。 （4）供试品管中生长的微生物经鉴定后，,药品微生物学检验,确证是因无菌试验中所使用的物品和无菌操作技术不当所引起的。 试验若经确认无效，应重试时，同样取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判断供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。,药品微生物学检验,微生物限度检查法一、细菌、霉菌和酵母菌计数1.简述 细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。,药品微生物学检验,细菌、霉菌和酵母菌计数除另有规定外均采用平板计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上常用的一种方法。以琼脂平板上的细菌、霉菌或酵母菌形成的一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（嗜中温、需氧和兼性厌氧菌)、霉菌和酵母菌的菌落数，不包括对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。,药品微生物学检验,药品微生物学检验,一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位（cfu），不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。 在进行本法测定时，必须严格按本法规定的条件操作，以免产生实验误差。,药品微生物学检验,2.设备、仪器无菌室：微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室要有单独的净化空气系统。无菌室应有操作间和缓冲间，其要求与无菌检查项下相同。设备、仪器：恒温培养箱（30至35）、生化培养箱（23至28）、电热干燥箱、恒温水浴、电冰箱、离心机、薄膜过滤器、蒸汽灭菌器、菌落计数器、显微镜、电子天平、pH计、微波炉、匀浆仪等。,药品微生物学检验,玻璃器皿：锥形瓶、培养皿、量筒、试管、吸管、注射器、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸、不锈钢桶（带盖）。玻璃器皿用前应洗净，吸管、量筒不挂水珠，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm适宜疏松的棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞或棉塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用,药品微生物学检验,牛皮纸包扎。玻璃器皿均于高压蒸汽灭菌器内121灭菌30分钟，烘干或160 干热灭菌2小时，备用。用具：大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器内，并应定期用70%至75%的乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次无菌衣、帽、口罩、手套。,药品微生物学检验,接种环（白铱金或镍铬合金，环径4至5mm、长度6至10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀功灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药勺、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖、实验记录本等。3.试液、稀释剂和试剂： 0.1%苯扎溴铵溶液或其它适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）；,药品微生物学检验,5%石碳酸溶液或其它消毒液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）；75%乙醇溶液；碘酊或碘伏溶液。稀释剂配制后，高压蒸汽法灭菌。0.9%无菌氯化钠溶液；pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液；,药品微生物学检验,pH6.8无菌磷酸盐缓冲液；pH7.6无菌磷酸盐缓冲液；0.1%无菌氯化三苯四氮唑；pH7.2无菌磷酸盐缓冲液。4.培养基：营养琼脂培养基；玫瑰红钠培养基；酵母浸出粉葡萄糖琼脂培养基5、供试品抽样、保存及检验量,药品微生物学检验,5.1 抽样 一般采用随机抽样方法，其抽样量应为检验用（2个以上最小包装单位）的3至5倍量（以备复试或留样观察） 抽样时，凡发现有异常或可疑问的样品。应选取有疑问的样品。机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。 凡药品、瓶中（外盖内侧及瓶口周围）外观长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为,药品微生物学检验,不合格，无需再抽样检验。5.2 保存 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内在的污染菌因保存条件不妥导致死亡，损伤或繁殖。 供试品在检验之前，应保存原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。5.3 检验量 所有剂型的检验量均需取自2个以上的包装,药品微生物学检验,单位（中药蜜丸需取自4丸、膜剂取4片以上） 固体及半固体（黏稠必供试品）制剂检验量为10g。 液体制剂检验量为10ml。 膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为 25平方厘米（中药膜剂较厚，不宜取量过多），化学药及生化药膜剂检验量为50平方厘米。 特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于3g，,药品微生物学检验,液体制剂采用原液不得少于6 ml，采用供试液者不少于3ml，外用药品不得少于5g。 要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或者说10 ml。6 . 试验准备6.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管、量筒、稀释剂等经传递窗移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先做好计划，准备足够用量，避免操作中出,药品微生物学检验,入无菌间。编号后将全部外包装去掉。 6.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。 6.3 关闭紫外杀菌灯后，操作人员用肥皂洗手，进入缓冲间，换工作鞋。再用消毒液洗手或用乙醇棉花擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。 6.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏 棉球（也可以用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒,药品微生物学检验,袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。7.供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采用适宜的方法制备供试液。如使用了乳化剂、分散剂、中和剂或灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45度，30分钟。除另有规定外，常用的供试品,药品微生物学检验,制备方法如下： 7.1 液体供试品：取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀，作为供试液。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。 7.2 固体、半固体或黏稠液供试品：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪（3000-5000r/min，2-4min）或其他的有效方法，混匀 ，作为供试液。,药品微生物学检验,7.3 非水溶性供试品（略）7.4 非水溶性膜制剂供试品：化学药膜剂一般取样为100平方cm，置灭菌锥形瓶中，加入适量pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,于451水浴中保温、浸泡、振摇，以供试品浸液作为供试液。7.5 肠溶及结肠溶制剂供试品（略）7.6 气雾剂、喷雾剂供试品（略）7.7 茶剂（略）,药品微生物学检验,7.8 具抑菌性的供试品：应消除供试品的抑菌性后，再依法检查。常用的方法如下： 稀释法：取规定量的供试品，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。 离心沉淀集菌法 薄膜过滤法 中和法,药品微生物学检验,8.供试液的稀释（10倍递增稀释法） 8.1 取3至4支灭菌吸管吸1:10均匀供试液1