抗原与抗体

,抗原与抗体,2,抗 原一、抗原的概念1. 抗原(antigen)与抗原性(antigenicity) 凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞并能与之发生反应的物质称为抗原(Ag)。 抗原物质具有抗原性,包括免疫原性与反应原性。,3,免疫原性(immunogenicity) （抗原作用）指能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的特性。反应原性(reactinogenicity) （抗原反应）指抗原与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生反应的特性，此特性又称为免疫反应性(immunoreactivity)。,4,要 点：,5,T细胞,B细胞,6,2. 完全抗原与半抗原 抗原又分为完全抗原与不完全抗原。 既具有免疫原性又有反应原性的物质称为完全抗原(complete antigen) 。只具有反应原性而缺乏免疫原性的物质称为不完全抗原(incomplete antigen)，亦称为半抗原(hapten) 。如荚膜多糖、类脂、脂多糖。,7,二、构成抗原的条件（影响抗原免疫原性的因素）1. 异源性 又称异物性(foreigness) ，一般说来，只有非自身物质进入机体才能具有免疫原性。微生物、异种组织、细胞及蛋白质均是良好的抗原。通常动物亲缘关系相距越远，种系差异越大，免疫原性越好。有以下几种情况: 非动物性抗原 非动物性的物质，譬如植物蛋白(叶绿素等)、微生物等，对动物宿主有良好的免疫原性。 异种动物抗原 动物之间血源关系相距越远，生物种系差异越大、免疫原性越好。譬如:鸭源蛋白质对鸡的免疫原性较弱，而对兔则是良好的免疫原。 同种异体抗原 同种动物异体间的某些物质也有免疫原性，譬如血型抗原、组织相容性抗原等。 自身抗原 动物自身的组织通常情况下不具有免疫原性。,8,2. 大分子 抗原的免疫原性与其分子大小有直接关系。免疫原性良好的物质分子量一般都在10000以上 ，在一定条件下，分子量越大，免疫原性越强。分子量小于5000其免疫原性较弱。分子量在l 000以下的物质为半抗原，没有免疫原性。但与蛋白质载体结合后可获得免疫原性。3. 分子结构 相同大小的分子如果化学组成、分子结构和空间构象不同，其免疫原性也有一定的差异。一般讲，分子结构和空间构型越复杂，免疫原性越好。芳香环结构比直链结构强。,9,4. 物理性 颗粒性抗原的免疫原性通常比可溶性抗原强。可溶性抗原分子聚合后或吸附在颗粒表面可增强其免疫原性。例如将甲状腺蛋白与聚丙烯酰胺颗粒结合后免疫家兔可使IgM的效价提高20倍。免疫原性弱的蛋白质如果吸附在氢氧化铝胶、脂质体等大分子颗粒上可增强其免疫原性。5. 完整性 所以抗原物质通常要通过非消化道途径以完整分子状态进入体内，才能保持抗原性。,10,三、抗原的交叉性 不同抗原物质之间存在相同的抗原决定簇，这种现象称为抗原的交叉性。这些共有的抗原组成或决定簇称为共同抗原或交叉抗原。如果两种微生物有共同抗原，它们与相应抗体相互之间可以发生交叉反应。,11,四、抗原的分类（一）抗原分类 抗原有多种分类方法，大致如下: 1. 按抗原的性质分类分：,抗原,完全抗原,不完全抗原（半抗原）,简单半抗原,复合半抗原,12,2. 按来源分异种抗原 与免疫动物不同种属的抗原，如微生物抗原，异种动物红细胞，异种动物蛋白。同种抗原 与免疫动物同种属不同个体的抗原，能刺激同种而基因型不同的个体产生免疫应答，如血型抗原、同种移植物抗原。自身抗原 动物的自身组织细胞、蛋白质在特定条件下形成的抗原，对自身免疫系统具有抗原性。异嗜性抗原 指与种属特异性无关，存在于人、动物、植物及微生物之间性质相同的抗原(交叉抗原)。该现象首先由瑞典病理学家Forssman (18681947)发现的，故又称为Forssman抗原。,13,3. 根据对胸腺(T细胞)的依赖性分类胸腺依赖性抗原： 这类抗原在刺激B细胞分化和产生抗体的过程中需要辅助性T细胞的协助。多数抗原都属此类，如异种组织与细胞、异种蛋白及人工复合抗原等。非胸腺依赖性抗原这类抗原直接刺激B细胞产生抗体，不需要T细胞的协助。如大肠杆菌脂多糖、肺炎球菌荚膜多糖等。,14,同种异型,异种抗原,新生儿溶血症,孕妇(Rh-),胎儿(Rh+),抗Rh抗体（IgG）,新生儿RBC (Rh+),溶血反应,16,17,4. 根据化学性质分类,糖蛋白,脂蛋白,脂质,多糖,核酸,抗原,18,（二）微生物抗原1. 按保护性分 保护性抗原和非保护性抗原。2. 按微生物种类分 细菌抗原 细菌的抗原结构比较复杂，每个菌的每种结构都由若干抗原组成，因此细菌是多种抗原成分的复合体。有菌体抗原、荚膜抗原、鞭毛抗原和菌毛抗原等。,19,菌体抗原 又称O抗原，是革兰氏阴性菌细胞壁抗原，其化学本质为脂多糖的多糖侧链。鞭毛抗原 又称H抗原。鞭毛抗原主要决定于鞭毛丝。荚膜抗原 又称K抗原。荚膜是细菌主要的表面抗原，成分为多糖或多肽。菌毛抗原 菌毛由菌毛素组成，有很强的抗原性。毒素抗原 外毒素的成分为糖蛋白或蛋白质，具有很强的抗原性，能刺激机体产生抗体(即抗毒素)。,20, 病毒抗原 各种病毒都有相应的抗原结构。如囊膜抗原、衣壳抗原、可溶性抗原和核蛋白抗原。 囊膜抗原（V抗原） 有囊膜病毒，抗原特异性主要是囊膜上的纤突所决定的。如流感病毒HA和NA，是流感病毒亚型分类基础。衣壳抗原（VC抗原） 无囊膜病毒，其抗原特异性决定于病毒颗粒表面的衣壳蛋白。如口蹄疫病毒的衣壳蛋白VP1、 VP2 、VP3 、 VP4 等属此类抗原。可溶性抗原（S抗原)。核蛋白抗原 (NP抗原)。,21,二、抗体(Antibody，Ab) 机体免疫细胞被抗原激活后，由B细胞分化成熟的浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,22,免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)(1)定义：具有抗体活性或化学结构与抗体分子 相似的球蛋白。 (2)存在形式： 膜型 B细胞膜上的抗原受体 分泌型分泌进入体液, 介导体液免疫应答,23,24,1、免疫球蛋白的分子结构,1）重链（H链）和轻链（L链）2）可变区（V区）和恒定区（C区）3）铰链区4）水解片段,25,1、免疫球蛋白的分子结构,26,27,2、各类Ig的主要特性与功能 IgG 特性 是人和动物血清中含量最高的Ig，占血清Ig总量的75-80。IgG是介导体液免疫的主要抗体，多以单体形式存在，分子量为160000180000 。产生与分布 IgG主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞产生，大部分(45%50%)在血浆中，其余存在于组织液和淋巴液中。IgG是惟一可通过人(和兔)胎盘的抗体，在新生儿的抗感染中起重要作用。,28,IgG的功能 IgG是动物机体抗感染免疫的主力，同时也是血清学诊断和疫苗免疫后监测的主要抗体。IgG在动物体内不仅含量高，而且持续时间长， 可发挥抗菌、抗病毒、抗毒素以及抗肿瘤等免疫学活性.能调理、凝集和沉淀抗原，与抗原结合后能结合补体。,29,2. lgM 特性 是动物机体初次体液免疫应答最早产生的免疫球蛋白， IgM是由五个单体组成的五聚体，是所有Ig中分子量最大的,分子量为900000左右，又称为巨球蛋白(macroglobulin) 。 产生与分布 IgM主要由脾脏和淋巴结中B细胞产生，只分布于血液中，仅占血清lg的10左右。IgM在体内产生最早，在抗感染免疫的早期起着十分重要的作用。,30,IgM的功能 与IgG相比，IgM在体内产生最早，但持续时间短，因此不是机体抗感染免疫的主力，但由于它是机体初次接触抗原物质(接种疫苗)时体内最早产生的抗体，因此在抗感染免疫的早期起着十分重要的作用，也可通过检测IgM抗体进行血清学的早期诊断。IgM具有抗菌，抗病毒，中和毒素等免疫活性，由于其分子上含有多个抗原结合部位，所以它是一种高效能的抗体，其杀菌、溶菌、溶血、促进吞噬(调理作用)及凝集作用均比IgG高(大约高5001000倍)。,31,3. IgA 特性 以单体和二聚体两种分子形式存在。单体存在于血清中，称为血清型IgA，约占血清Ig的10-20；二聚体为分泌型IgA。 产生与分布 分泌型IgA是由粘膜固有层中的浆细胞所产生。主要存在于各种分泌液中。分泌型IgA对机体呼吸道、消化道等局部粘膜免疫起着相当重要的作用，可抵御经粘膜感染的病原微生物。在传染病预防中，经滴鼻、点眼、饮水及喷雾途径免疫，均可产生分泌型IgA而建立相应的粘膜免疫力。,32,IgA功能血清型的IgA同样具有抗菌、抗病毒、抗毒素等免疫学活性。分泌型的IgA对机体呼吸道、消化道等局部粘膜免疫起着相当重要的作用，特别是对于一些经粘膜感染的病原微生物，动物体的这种粘膜免疫功能就显得十分重要，若动物体呼吸道、消化道分泌液中存在这些病原微生物的相应的分泌型IgA抗体，则可抵抗其感染，因此分泌型IgA是机体粘膜免疫的一道屏障。在传染病的预防接种中，经滴鼻、点眼、饮水等途径免疫，均可产生相应的粘膜免疫力。,33,4.IgE IgE的产生部位与分泌型IgA相似，在血清中的含量甚微。IgE是一种亲细胞性抗体，易与皮肤组织、肥大细胞、血液中的嗜碱性粒细胞和血管内皮细胞结合，可介导I型过敏反应。 IgE在抗寄生虫、某些真菌感染方面也有重要作用。,34,35,5.IgD 特性 很少分泌，在血清中的含量极低，而且不稳定，容易降解。 IgD分子量为17-20万。迄今对血清中的IgD的结构和功能尚不完全清楚，是否具有抗感染作用也未证实。有报道认为IgD与某些过敏反应有关，如抗青霉素和牛奶过敏性抗体以及一些自身免疫病抗体，有的属于IgD 。 功能 IgD主要作为成熟B细胞膜上的抗原特异性受体，是B细胞的重要表面标志。此外IgD与免疫记忆与某些过敏反应有关。,36,五、 抗体的制备,抗体制备技术是免疫学工作者经常采用的一项技术。当今，免疫学已进入分子水平时代，因此抗体的制备亦已步入分子水平。人工制备抗体的类型有三种:即多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体。,37,（一）人工制备抗体的种类1. 多克隆抗体(polyclonal antibody，PcAb) 采用传统的免疫方法，将抗原物质经不同途径（皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结注射等或点眼、滴鼻、饮水等）注入动物体内，经免疫后，分离出血清，由此获得的抗血清即为多克隆抗体。细菌病毒抗原，均是由多种抗原成分组成，即使纯蛋白质抗原分子也含有多种抗原表位，因此进入机体后可激活许多淋巴细胞克隆，机体可产生针对各种抗原成分或抗原表位的抗体，由此获得的抗血清是一种多克隆的混合抗体，具有高度的异质性。一只小鼠能产生约107-108 种不同抗体，人约109种。,38,2. 单克隆抗体(McAb) 由一个B细胞分化增殖的子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 McAb的特点 McAb的重链、轻链及其V区独特型的特异性、亲和力、生物学性状及分子结构均完全相同。,39,McAb技术原理 Khler 和Milstein在1975年建立了体外淋巴细胞杂交瘤技术，用人工的方法将产生特异性抗体的B细胞与同系骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞无限繁殖特性，又具有B细胞分泌特异性抗体的能力，由克隆化的B细胞杂交瘤所产生的抗体即为单克隆抗体。,40,单克隆抗体的问世，极大地推动了免疫学及其他生物科学的发展，并于1984年获得诺贝尔奖。McAb优点 与多克隆抗体比较， McAb具有无可比拟的优越性，具有高特异性、高纯度、均质性好、亲和力不变、重复性强、效价高、成本低、并可大量生产等优点。,41,（二）B细胞杂交瘤株建立与McAb生产技术基本过程 B细胞的制备、骨髓瘤细胞的制备-细胞融合-检测抗体-杂交瘤细胞的克隆化-细胞株冻存或单克隆抗体的生产 。,42,(1) B细胞的制备 可用提纯的抗原免疫Balb/c或其他品系小鼠，免疫2-3次间隔2-4周，最后一次免疫后3-4d，取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液，即为亲本的B细胞。 (2) 骨髓瘤细胞的制备 用与免疫相同品系小鼠的骨髓瘤细胞，要求其本身不能分泌Ig，而且具有某种营养缺陷，可用SP2/0或NS-1，它们缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，不能在HAT培养基上生长。 (3) 饲养细胞的准备 常用小鼠巨噬细胞或胸腺细胞作为饲养细胞。,43,(4) 选择培养基 常用HAT选择培养基，H为次黄嘌呤，T为胸腺嘧啶核苷，二者都是旁路合成DNA的原料；A是氨基喋呤，是细胞内源性合成DNA的阻断剂。在该培养基中，未融合的骨髓瘤细胞不能生长，因它不能利用旁路途径合成DNA，内源性的合成又受到氨基喋呤的阻断；至于未融合的脾细胞则在2周内自然死亡，所以只有融合的杂交瘤细胞才能在该培养基中生长。,44,(5) 细胞融合 将脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例(一般3:1-5:1)混合，离心后弃上清液，然后缓慢加入融合剂50聚乙二醇(PEG4000)，摇动试管。静置90s，逐渐加入HAT培养基，分于加有饲养细胞的96孔培养板孔中，置5-10CO2培养箱中培养。5d后更换一半HAT培养基，再5d后改用HT培养基，再经5d后用完全DMEM培养基。,45,(6) 检测抗体 杂交瘤细胞培养后，应用敏感的血清学方法检测各孔中的抗体。视抗原性质的不同，可采用放射免疫分析、酶联免疫吸附试验、免疫荧光抗体技术间接法等。通过检测筛选出抗体阳性孔。,46,(7) 杂交瘤细胞的克隆化 对于抗体阳性孔的杂交瘤细胞，应尽早克隆化，一方面是保纯：获得的杂交瘤细胞株是由一个细胞增殖而来的，即单个克隆；另一方面防止染色体丢失：防杂交瘤细胞因染色体丢失而丧失分泌抗体的能力。 一般需反复克隆3-5次方能使杂交瘤细胞稳定。克隆的方法包括有限稀释法、显微操作法和软琼脂平板法。,47,(8) 单克隆抗体的生产 获得稳定的杂交瘤细胞克隆后，即可用于生产单克隆抗体。可采用的方法有：可将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，瘤细胞可在小鼠腹腔中无限繁殖，导致腹水产生，腹水可获得5-20mg/ml的单克隆抗体。将杂交瘤细胞进行大量细胞培养后，收集培养液分离获得大量的单克隆抗体；可利用微球技术制备单克隆抗体。,48,单克隆抗体的制备,49,50,51,（三）基因工程抗体(genetic engineering antibody)利用基因工程技术来制备的抗体分子称为基因工程抗体，是分子水平的抗体。基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子，可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少无关结构(如Fc片段)，从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷(如鼠源单克隆抗体在人体内使用会引起抗体产生而降低其效果，Fc片段的无效性的副作用)，因此基因工程抗体更具有广阔的应用前景。,52,1. 嵌合抗体(chimeric antibody) 又称杂种抗体，是指在同一抗体分子中含有不同种属来源抗体片段的抗体。迄今构建的嵌合抗体多为鼠人类型，也就是抗体的Fab或F(ab)2来源于鼠类，而Fc片段来源于人类。可将小鼠VH基因与人的CH基因连接后导入骨髓瘤细胞，使之表达嵌合重链，再将小鼠杂交瘤细胞的VL与人CL基因相连，转染含嵌合重链的小鼠骨髓瘤细胞，经过筛选即可得到分泌鼠人嵌合抗体的骨髓瘤细胞，其所分泌的嵌合抗体与原杂交瘤细胞分泌的抗体特异性和亲和力相同，但减少了抗体中的鼠源性成分。,53,54,55,2. 重构型抗体(reshaping antibody) 尽管嵌合抗体具有一些优点，但该抗体中仍然有近50%的成分来自小鼠。因此为进一步减少鼠源蛋白在嵌合抗体内的含量，将鼠抗体的超变区基因嵌入人抗体Fab骨架区的编码基因中，再将此DNA片段与人免疫球蛋白恒定区基因相连，然后转染杂交瘤细胞，使之表达嵌合的V区抗体。实际上也就是在人抗体可变区序列内嵌入鼠源抗体的高变区基因序列，通过这种置换为人类抗体提供了一个新的抗原结合部位。,56,57,58,3. 单链抗体(Single-chain antibody)又称FV分子。由于抗体的分子量较大，体内应用时受到一定的限制。因此可用基因工程手段构建更小的具有结合抗原能力的抗体片段，即FV分子或单链抗体蛋白。这种单链抗体是由VL区氨基酸序列与VH区氨基酸序列经肽连接物（linker)连接而成。,59,60,此外肽连接物还可将药物、毒素或同位素与单链抗体蛋白相融合。这类抗体具有分子量小，作为外源性蛋白的免疫原性较低；在血清中比完整的单克隆抗体或F(ab)2片段能更快地被清除；无Fc片段，体内应用时可避免非特异性杀伤；能进入实体瘤周围的微循环等优点。,61,62,63,4. Ig相关分子 可将抗体分子的部分片段(如V区或C区)连接到与抗体无关的序列上(如毒素)，就可创造出一些Ig相关分子，例如可将有治疗作用的毒素或化疗药物取代抗体的Fc片段，通过高变区结合特异性抗原，连接上的毒素可直接运送到靶细胞表面，起生物导弹的作用。Byrn构建的CD4免疫粘附素即是这一类抗体分子，他是将CD4基因与IG1C区在体外重组而表达出的Ig相关分子，它可封闭人HIVgpl20 蛋白与CD4+T细胞的结合，在治疗人的爱滋病上具有重要意义。,64,5. 噬菌体抗体(phage antibody)这是一类近年刚开始研究的基因工程抗体。是将已知特异性的抗体分子的所有V区基因在噬菌体中构建成基因库，用噬菌体感染细菌，模拟免疫选择过程，具有相应特异性的重链和轻链可变区即可在噬菌体表面呈现出来。这种技术称为噬菌体表面表达技术(phage display technology)。这种抗体作为研究和治疗用试剂具有广阔的应用前景。,65,66,67,68,六、抗体的分类1. 根据抗原的来源异种抗体 由异种抗原免疫产生的抗体均称为异种抗体，如各种微生物抗体、对异种蛋白和细胞的抗体，因此大多数抗体均属于此类。同种抗体 由同种属动物之间的抗原物质免疫所产生的抗体，如血型抗体，组织相容性抗原的抗体。自身抗体 针对自身抗原所产生的抗体，如抗核抗体、抗自身Ig的抗体。,69,2. 根据有无抗原刺激天然抗体 指无明显抗原刺激而天然存在于动物体内的抗体，如存在于人血清中的天然血型抗体，A型人血清中有B型红细胞抗体，B型人血清中有A型红细胞抗体。免疫抗体 指自然感染，人工免疫动物所产生的抗体。,70,3.按Ig的类型分 IgG、IgM、1gA、IgE、IgD抗体。4.按反应表现分 沉淀素、凝集素、溶解素、调理素、补体结合抗体、中和抗体、保护性抗体等。,71,第四节 抗体产生的克隆选择学说 在免疫学发展的不同时期，不同的学者们提出了不同的关于抗体产生的学说。但在50年代以前提出的侧链学说，诱导学说，自然选择学说均未能圆满地解释上述问题，直到1959年，澳大利亚免疫学家Burnet在研究免疫耐受性和自然选择学说的基础上，提出了一个公认的比较合理的抗体产生理论，即克隆选择学说。,72,一、克隆选择学说的基本思想 克隆选择学说认为抗原进入机体选择的不是所谓存在于体内的自然抗体，而是事先存在于淋巴细胞膜表面的抗原受体，即后来证明是膜表面免疫球蛋白(Smlg)。,73,动物体内存在有无数多的淋巴细胞克隆(估计约107个)，每一克隆表面都带有特异性的SmIg，进入体内的外来抗原或内源性抗原可选择性地激活带有相应受体的淋巴细胞克隆，进而使其分化增殖，产生抗体；同时该学说强调决定抗体结构的是淋巴细胞的基因，抗原不能改变或修饰编码抗体的基因。,74,75,二、克隆选择学说对几个问题的解释(一)对抗体产生多样性的解释 动