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01绪论代谢工程概述 1 2 本章内容 1 1代谢工程的产生和概念的演变 1 2代谢工程的研究内容 1 3代谢工程的应用领域和前景 3 第一节代谢工程的产生和概念的演变 现代生物技术手段主要包括基因工程 GeneEngineering 细胞工程 CellEngineering 发酵工程 FermentationEngineering 酶工程 EnzymeEngineering 和生化工程 BiochemicalEngineering 现代生物技术在化工 医药卫生 农林牧渔 轻工食品 能源和环境等领域都将发挥重要作用 可促进传统产业的改造和新型产业的形成 对人类社会产生深远影响 其中发酵工程是生物技术的重要组成部分 是生物技术转化成产品的重要环节 20世纪90年代提出的代谢工程发展迅速 被视为继传统的蛋白质多肽单基因表达 第一代基因工程 基因定向突变 第二代基因工程 之后的第三代基因工程 4 代谢研究的产生和发展历史 微生物发酵已经有几千年的历史 早在2000年以前 人们就开始利用微生物进行白酒 黄酒 清酒的发酵 此时的发酵为天然发酵时代 20世纪40年代 随着抗生素青霉素的发酵生产的大规模进行 开始了现代发酵工业时代 通过自然选择的方法 人们用10 6的突变几率来筛选所谓的高产菌株 由于没有代谢控制发酵理论作为指导 直到20世纪60年代现代发酵工业仍处于盲目阶段 1957年 日本的木下等人开始了谷氨酸的发酵研究 随着各国对代谢发酵理论的深入研究 许多国家转向发酵菌株本身的研究 获得了许多的氨基酸高产菌株 随后 核酸类物质发酵生产菌也以代谢控制发酵理论为指导进行选育 并奋起直追成为后起之秀 5 早期的代谢研究主要内容 早期研究中侧重应用过程中采用的方法及所达到的目标 通常是对细胞特定的代谢途径进行改造 代谢控制发酵就是利用遗传学的方法或生物化学方法 人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢 使目的产物大量的生成 积累的发酵 代谢控制发酵的核心为 解除微生物代谢控制机制 打破微生物正常的代谢调节 人为地控制微生物的代谢 6 随着代谢控制发酵理论的日臻完善 目前已发展出一个重要的研究分支 代谢工程 它是近年来分子生物学 生物化学 化学工程学和计算机科学的发展与交差的产物 从而使生物技术突飞猛进的发展 使有关的研究进入了细胞水平 从细胞的代谢途径出发 运用工程学原理进行代谢调控 使之向产物积累的方向发展 由此创建了一个新兴的领域 即 代谢工程 7 代谢工程概念演变 8 代谢工程的现代概念 代谢工程也被人们成为 途径工程 它属于基因工程的一个重要的分支 它应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传手段 进行有精确目标的遗传操作 改变酶的功能输送体系的功能 以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作 包括代谢分析 代谢设计 遗传操作 目的代谢活性的实现 是一种生物化学反应代谢网络有目的的修饰 9 代谢工程的一些基本定义 底物 培养基质中的化合物 是能被细胞进一步代谢或直接利用构成细胞组分 碳源 氮源 能源物质以及满足细胞功能必须的各种矿物质元素均属于细胞代谢的底物 代谢产物 由细胞合成的化合物 可以是初级代谢产物 二氧化碳 乙醇等 也可以是次级代谢产物或者蛋白质 生物基质要素 构成生物质大分子池的一类物质 包括DNA RNA 蛋白质等 10 代谢工程的一些基本定义 代谢流和碳骨架物质流 代谢物在代谢途径中流动形成代谢流 在代谢工程领域代谢流往往是指骨架物质流 代谢主流 在一定的培养条件下 代谢物再代谢网络中流动 流量相对集中的代谢流叫做该条件下的代谢主流 代谢途径的延伸和改变都会改变代谢主流 从而实现新基质的利用和新产品的开发 代谢主流的测定是代谢工程的重要组成部分 11 代谢工程的一些基本定义 载流途经 代谢主流流经的代谢途径为主要载流途经 简称载流途经 在代谢工程研究中载流途经是指碳流在代谢网络中通过的主要途径 代谢主流的变动性和选择性 生物细胞的代谢主流处于不断的变化之中 其方向 流量甚至代谢主流的载流途经都可能发生变化 这就是代谢主流的变动性和代谢主流对代谢网络途径的选择性 这种变动和选择的根据在于生物细胞的遗传物质 选择的原因在于细胞所处的环境条件的变化 12 代谢工程的一些基本定义 代谢途径定义为 一连串可以进行的并可观测的生物化学反应步骤 这些反应步骤是以指定的一组输入和输出代谢物所连结 13 代谢工程的一些基本定义 代谢网络 在代谢过程中 通过特定的生物化学反应 一些物质被分解 从而为基本的生命过程提供能量 同时合成另一些生命所必需的物质 发生在某物种的活细胞内所有代谢反应构成了此物种的代谢网络 对蛋白质层次的代谢网络来说 一个代谢物分子就是一个节点 而节点之间的连结则是生化反应 大部分的分子只参加一种或两种反应 但少数分子参与许多反应 它们实际上就是代谢流的集散中心或通用代谢物 14 代谢工程的一些基本定义 代谢通量定义为 输入代谢物反应生成输出代谢物的速率 胞内代谢通量的确定称为代谢通量分析 metabolicfluxanalysis MFA 其在代谢工程处于中心地位 15 代谢工程的一些基本定义 代谢控制分析 MCA etabolicControlAnalysis 简称 代谢工程的一个主要目标就是对代谢通量控制的理解 其是通过途径中酶的活性 代谢物 效应物和其它参数所施加的通量控制程度进行定量表述 代谢控制的关键参数确定以后 人们需要实施这些变化从而最有效地达到预定目标 在实施通量控制的策略中 无论采用哪种路线 为获得最佳的结果 都应将基因修饰和环境条件改变结合起来使用 16 第二节代谢工程的研究内容 代谢工程的实质在于对代谢网络进行定量分析 并且在此基础上进行代谢改造 代谢网络重组 以最大限度地提高代谢产物的产率 主要内容 生物合成相关代谢调控和代谢网络理论代谢流的定量分析代谢网络的重新设计中心代谢作用机理及相关代谢分析基因操作 17 代谢工程研究的目的 通过重组DNA技术构建具有能合成目标产物的代谢网络或具有高产能力的工程菌 细胞株 生物个体 并用于生产是代谢工程研究的主要目的 18 代谢网络理论 代谢网络理论是把细胞的生化反应以网络整体而不是孤立地考虑 细胞代谢的网络由上万种酶催化的系列反应系统 膜传递系统 信号传递系统组成 并且既受精密调节 又彼此互相协调 代谢网络理论是代谢工程研究的基础 19 代谢分析 代谢分析是代谢工程的重要组成部分 它涉及代谢流的定量和定向 研究细胞内代谢物浓度的反应工程方法以及细胞内稳态流分析等 20 代谢工程的实质 代谢工程最重要的贡献在于其强调在胞内条件下代谢通量及其调控 代谢工程的实质是 将通量及其控制进行量化的方法与分子生物学技术结合起来 用以执行所建议的基因修饰任务 当反复利用代谢工程方法时 它就为在很广范围内系统改进细胞的性质提供了一种强有力的方法 通量是细胞生理学的一个基本决定因素 也是代谢途径中最重要的参数 21 代谢工程与随机诱变的区别 尽管定向性从某种意义上来讲是所有菌种改进工作的固有特性 但是代谢工程与随机诱变相比 其工作焦点致力于定向性 以致其在目标酶的选择 实验设计以及数据分析等方面都起着重要的作用 另一方面 细胞的定向改进应解释为合理的途径设计与修饰 因此在这个意义上说 代谢工程与随机诱变是完全不同的 实际上 通过随机诱变而得到的性能优良的菌株能够作为关于途径结构与控制方面重要信息的来源 这可经由反向代谢工程获取 22 代谢工程也包括两个明确的步骤 即分析与合成 因为代谢工程是随着DNA重组而出现的可行技术 所以最初代谢工程几乎都集中于这个领域的合成方面 如在各种宿主细胞中新基因的表达 内源酶的扩增 基因的缺失或酶活性的调节 转录的或酶的解除调控等 因此 代谢工程在很大程度上曾是应用分子生物学的技术体现 而很少带有工程方面的内容 23 代谢工程的主要特征 代谢工程的主要特征就是利用DNA重组技术 重建代谢网络 改变代谢流及分支代谢速度 以改进代谢产物及蛋白类产品 由于外源DNA的引入扩展了固有的代谢途径 获得了新的化学物质 改变转化蛋白的过程 减少不必要的废物 24 代谢工程研究的主要问题 提高细胞已有的代谢途径中天然产物的产量改变细胞已有代谢途径 合成新产物对不同细胞的代谢途径进行整合 构建全新的代谢途径优化细胞的生物学特性 如生长速率 耐受性等 25 代谢工程的研究手段 1 采用遗传学手段的遗传操作 1 基因工程技术的应用 2 常规诱变技术的应用2 生物合成途径的代谢调控 1 生物合成中间产物的定量生物测定 2 共合成法在生物合成中的应用 3 酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏 4 无机磷对生物合成的调节3 研究生物合成机制的常用方法 1 刺激实验法 2 同位素示踪法 3 洗涤菌丝悬浮法 4 无细胞抽提法 5 遗传特性诱变法 26 代谢工程的研究方法 1分子生物学方法 构建特殊的基因转移系统 尤其对于具有较高生产价值的微生物 具有重要意义 例如Backman等利用切割载体获得Tyr营养突变型 为构建苯丙氨酸的生产菌株奠定基础 2分析化学及检测方法 代谢工程的研究对象是代谢途径 因此必须对代谢通路中的一些酶及产物进行研究和分析 传统的分析通路阻断的手段有 物质平衡 同位素标记 分析障碍突变体等 目前它们仍然是必不可少的手段 而核磁共振 流氏细胞术的应用则为这一领域的发展增添了新的活力 3数学及计算机工具 研究代谢工程不仅需要遗传学知识 而且需要对宿主菌的生化代谢途径和生理学有深入的理解 所以将DNA数据库的信息应用于代谢工程并开发出适合的软件系统是十分必要的 Karp等构建了981个生命体化合物数据库 为未来的发展奠定了基础 人们已在实验的基础上结合数学和化学的理论 发展了一些人工智能程序 27 代谢工程的基本过程 1 代谢分析与代谢设计 代谢工程的研究对象是代谢途径 因此必须对代谢网络中的一些酶及产物进行研究和分析 根据代谢流的分析确定代谢设计的合理靶点 设计合适的代谢工程操作手段 对于靶点进行改造 达到改造代谢的目的 28 代谢工程的基本过程 2 基因操作 代谢改造的核心是在分子水平上对于靶基因或基因簇进的克隆 表达 修饰 敲除 调控 构建特殊的基因转移系统以及重组基因在细胞染色体DNA上的稳定整合 29 代谢工程的基本过程 3 效果分析 通常一次性的代谢设计和基因操作往往不能达到实际生产所要求的产量 速率或浓度 因此对于一次代谢改造的效果分析 得到本次操作的优点和缺点数据 改进缺陷 综合优势 进行下一次代谢改造 经过不断的改造和分析 可以得到好的结果 30 代谢工程的三个基本观点 随着生物化学 细胞生物学 应用分子生物学 遗传工程和代谢工程的发展 工业发酵正在经历一个从技艺到科学的重大变化 正在向微生物生物工程过渡 在生物工程受到广泛重视的今天 有必要把微生物 菌种选育 微生物学过程 发酵工艺 和微生物学体系 生物反应器 作为一个整体 在科学的水平上对工业发酵进行重新审视 31 代谢工程的三个基本观点 从工业发酵的现状出发 主要根据对碳元素代谢及其控制 菌种是化能异养型微生物 产物是微生物细胞排出细胞的代谢中间产物的工业发酵 提出了3个基本观点 32 代谢工程的三个基本观点 1 1生物能支撑观点微生物细胞是工业发酵产物的生产者 微生物细胞的生长和维持需要由其自身的能量转换机构或从其他形式的能量转化形成的生物能来支撑 因此 工业发酵具有生物学属性 1 2代谢网络观点由生化反应网络和跨输送步骤组成的代谢网络既没有绝对的起点 也没有绝对的终点 代谢网络中任何一种中间产物 或可借助生物学 化学方法与代谢网络联网的任何一种化合物 都可能被开发成为工业发酵的目的产物或原料 1 3细胞经济观点微生物细胞的经济性是在自然选择的过程中逐渐形成的 野生的 未经人工变异的 微生物细胞在自然选择的过程中逐渐形成竞争型的细胞经济 而工业发酵往往要以目的产物的生产为主导 调整代谢网络中的代谢流 构建一种导向型细胞经济 从竞争型细胞经济的转变取决于遗传和环境因素的信息导向 这种导向必须遵循细胞经济的基本运行规律 33 代谢工程研究的设计思路 在具体的设计和操作中 一般从以下方面着手 1 提高通向目标产物的代谢流 2 扩展代谢途径 3 构建新的代谢途径 提高通向目标产物的代谢流的手段通常有 a 增强催化限速反应的酶的表达量或活性 从而提高代谢流 b 在有竞争途径 如分支代谢途径 存在时 阻断有害的或无关的竞争代谢途径代谢产物的合成 从而达到改变代谢流 提高目标产物产量的目的 34 扩展代谢途径一般是指通过基因工程手段引入外源基因 簇 等 使原有代谢途径进一步向前或向后延伸 从而可利用新的原料用于合成目标产物或产生新的末端代谢产物 构建新的代谢途径一般是指引入外源基因 簇 来改造和修饰代谢网络 使细胞从不能合成某种代谢产物转变为能够合成此代谢产物 常用的手段有 a 转移代谢途径 即将多个特定代谢途径中的相关基因 簇 转移到无这些基因的菌株 或植物细胞等 中 从而达到使其能合成新的目标产物的目的 b 将无关的代谢途径相连 形成新的代谢途径 从而合成新的目标产物 35 习题 etabolicControlAnalysis 简称 36 第三节 代谢工程的应用领域和前景 代谢工程和微生物发酵工业要解决的根本问题是 如何有效地改造微生物菌种 使其高效地发酵生产各种产品 37 代谢工程是利用基因工程技术改造细胞的代谢 以改善细胞的性能的一门新兴学科 2003年美国贝克莱大学J Keasling 采用酵母细胞表达天然植物药箐篙素分子 实现工程微生物代谢工程制药 采用系统生物学原理和转基因生物技术 计算机软件辅助设计技术 将细胞内次生代谢反应链重新设计 人工合成基因与基因调控网络 从而进入了代谢工程 基因工程的合成生物学 系统生物学基础的遗传工程时代 38 代谢工程的主要目标是识别特定的遗传操作和环境条件的控制 以增强生物技术过程的产率及生产能力 或对细胞性质进行总体改性 本书最主要的内容包括途径集成和把代谢通量作为细胞生理学的基本决定因素来考虑的重要性 代谢工程把数学的复杂性减到最小 并同时提供一些必要的补充说明作为不同数学运算的背景材料 39 发酵产品 代谢工程研究的第一步必然是先确定要发酵生产什么产品 微生物发酵产品主要分为3大类 可再生能源 大宗化学品 和生物材料 精细化合物 可再生能源类目前研究的比较多的是纤维素乙醇 生物柴油 丁醇 然而目前的生物能源有着很多缺陷 将来很有必要开发品质高 原材料丰富的下一代生物能源 如长链醇 油酯和碳氢化合物 大宗化学品类目前研究比较多的是柠檬酸 溶剂 乳酸 聚羟基烷酸 1 3 丙二醇 丁二酸以及这些化学品聚合生产的生物材料 如生物塑料 生物橡胶 40 然而目前能工业化发酵生产的大宗化学品数量还非常有限 将来很有必要继续开发生产新型大宗化学品的代谢工程菌 全方位地使生物制造技术代替传统的化工制造技术 3 羟基丙酸 丙烯酸 二羟基酸类 天冬氨酸 糖醇类 1 2 丙二醇 1 4 丁二醇的代谢工程菌改造有希望在短期内取得重大突破 精细化合物目前研究比较多的是氨基酸 核酸 类异戊二烯化合物 如青