细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题.

细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题 摘要 本文对细菌内毒素检查方法的建立 限值的确定 方法学验证及常见问题进行了介 绍 在建立细菌内毒素检查法之前 应尽可能多的收集有关该药品的基本信息 例如 有关样 品的溶解性信息 推荐的稀释液 在水中的溶解度 以及最适溶剂 样品的 pH 范围 分子 量大小 产品规格 体积或重量 拟用于临床的用法和用量等等 以便选择合适的样品处 理方法和内毒素检查方法 对于早期研发阶段的药物 应选择合适的赋形剂 以有利于细 菌内毒素检查中对样品的稀释处理 此外 在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟 用剂量 为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间 一 细菌内毒素检查方法建立的主要步骤 对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时 首先应根据人体最大日给药剂量和给药 途径 计算和确定样品的内毒素限值 选择合适的鲎试剂 根据临床规格 计算最大有效 稀释倍数 稀释产品 并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查 可以采用凝胶法 也可 以采用终点法或动态法 当测定结果有争议时 除另有规定外 以凝胶法为准 1 细菌内毒素限值的确定 一个药品在投放市场前 它是否满足内毒素限值的要求 样品的内毒素含量具体是多少 这些问题不但关注用药安全 还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息 为药品 生产过程中质量控制提供警戒信息 尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研 究过程 但其最终目的还是要为控制药品质量服务 因此 在方法建立时 不但要阐明限 值的合理性 考虑技术可能达到的限值 同时还要满足相关药品管理法规的要求 研究人员在建立方法的早期 一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值 这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平 把限值订的相对比较严格 但往往由 于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍 所以严格的限值 可能会使得正式生 产时很多产品不能通过检查 从而造成不必要的浪费 因此参按照法规允许的最高水平 酌情确定样品的限值 样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关 剂量越大 单位重量或体积的 内毒素限值越低 一般按以下公式计算 内毒素限值 L K M 式中内毒素限值 L 是以 EU ml EU mg 或 EU u 表示 K 为按规定的给药途径 人体每公斤体重每小时最大可耐受的 内毒素剂量 以 EU kg h 表示 注射剂 K 5EU kg h 其中放射性药品注射剂 K 2 5EU kg h 鞘内用注射剂 K 0 2EU kg h 一般我国人群平均体重按 60kg 计 算 人体对细菌内毒素的最大耐受量为 300EU h 另我国人体的平均体表面积按 1 55m2 计 算 人体每平方米的最大耐受剂量为 300EU h 1 55m2 193EU h m2 M 为人体 每公斤体重每小时接受的最大给药剂量 以 ml kg h mg kg h 或 u kg h 表示 内毒素限值计算举例 一 A 注射剂的人体最大用量为每小时 1 5g 每公斤每小时体重 的剂量为 1 5g 60kg 0 025g kg 25mg kg 内毒素限值 L K M 5EU kg 25mg kg 0 2EU mg 在细菌内毒素检查法中 细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以 EU ml 表示 所以 在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为 EU ml 的表示方法 可使实验操作计算更为 方便 假定产品 A 的浓度为 100mg ml 或原料药经溶解后的浓度为 100mg ml 那么 将产品 A 的限值从 EU mg 转变为 EU ml 时 内毒素限值 L 0 2 EU mg 100 mg ml 20 EU ml 内毒素限值计算举例 二 B 注射剂的临床最大用药剂量为 1g m2 规格为 50mg ml 内 毒素限值 L 193 EU m2 1g m2 193 EU g 0 193 EU mg 转换为 EU ml 表示时 L 0 193 EU mg50 mg ml 9 65EU ml 大输液品种的限值一般定为 0 5EU ml 灭菌注射用水则定为 0 25EU ml 内毒素限值没有 考虑到几个药物联合用药问题 但一般情况下 药品中内毒素的含量远低于限值 并且药 品生产厂家的内控标准严于注册标准 所以药典内毒素限值也被称为最大允许内毒素浓度 Maximum allowable endotoxin concentration 2 样品最大有效稀释倍数或最小有效浓度的计算 最大有效稀释倍数 MVD 是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下 对产品进行最大倍数的稀释 仍能够进行内毒素限值的检测 此时所允许稀释的最大倍数 MVD 的计算公式为 当被规 定的内毒素的限值以体积表示时 MVD 内毒素限值 L EU ml 鲎试剂灵敏度 当内毒素的限值以重量或药品的生物活性 EU mg 或 EU u 表示时 MVD 内毒素限值 L EU mg 或 EU u 供试品溶液的浓度 C 鲎试剂灵敏度 在凝胶法中 鲎试 剂的标示灵敏度 EU ml 在浊度法或显色法中 所使用标准曲线上最低点的内毒素 浓度 EU ml 最小有效浓度 MVC 是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下 将产品稀释到一定浓度 仍能 够进行内毒素限值的检测 此时所允许的最小浓度 计算 MVC 的一般公式为 MVC 鲎试剂 灵敏度 内毒素限值 L 对所选定的鲎试剂灵敏度来讲 MVC 是一个绝对值 而 MVD 对特定的产品浓度是特异的 浓度变化时 MVD 也会随之发生变化 3 方法学验证试验的预试验 确定了样品的内毒素限值 考察了样品的溶解性 并且选定了一定灵敏度的鲎试剂 此时 便可以考虑进行预试验 尽管法规中并不要求进行预试验 但在细菌内毒素检查法的建立 过程中 一般需要进行预试验 预试验的主要目的是确定不出现干扰的第一个样品稀释度 也就是不干扰浓度 non interfering concentration NIC 为后续的验证试验选择适 当的样品稀释度 或浓度 不管采用凝胶法还是光度法 预试验都是对一系列样品的稀释液进行试验 在每一个稀释 浓度 都有一组添加内毒素的样品和一组不添加内毒素的样品 添加内毒素的浓度保持不 变 而样品浓度会逐级稀释 但最终样品的稀释倍数不得超过 MVD 可以采用直接把内毒 素添加到样品溶液中 添加内毒素的体积宜小 以免导致样品溶液被稀释 一般添加体积 等于或小于样品体积的 10 为宜 也可以采用下述方法添加内毒素 就是将两倍于终浓度 的内毒素溶液与两倍于终浓度的样品溶液等体积混合 内毒素和样品溶液间相互稀释 得 到两者所需终浓度的混合液 添加内毒素的浓度 凝胶法为 2 终点显色法为 4 这里 的 表示标准曲线上的最低点 也就是方法的检测限 动态显色法则有 3 种选择添加内 毒素浓度的方法 可以选择标准曲线的中点浓度 也可以与终点比色法一样 选择 4 此外 当样品稀释液中 内毒素的限值小于或等于 1 0EU ml 时 添加内毒素的浓度可定为 0 1 0 5EU ml 之间 当样品稀释液中 内毒素的限值大于或等于 1 0EU ml 时 添加内毒 素的浓度可定为 1 0 5 0EU ml 之间 对于凝胶法的结果判断 不添加内毒素的样品不应该凝集 如果发生凝集说明含有内毒素 或内毒素样物质 添加有内毒素的样品应该出现凝集 若没有发生凝集表明样品凝集反应 被抑制 光度法的结果判断标准为 测得的添加内毒素的量应该在已知添加量的 50 范围 内 超出范围 多或少 表明存在增强或抑制作用 通过预试验结果可以确定验证试验中样品的稀释度或浓度 其选择的基本原则包括 经稀 释后的样品含内毒素的量应尽可能少 比其内毒素限值至少少 4 倍 最好检测不到内毒素 要求验证试验选择的稀释度至少要比 NIC 大 1 2 倍 但不可超过 MVD 若样品需要多支合 并进行验证试验 此时试验不可采用原来的 MVD 因为假定合并样品中有一瓶存在污染 其它瓶没有污染 污染瓶含有的内毒素就会被其它没有污染瓶样品所稀释 并低于 MVD 从而检测不到污染的样品 因此 采用合并样品进行试验时 MVD 应降低 这种情况下的 MVD 等于原来的 MVD 除以合并样品的数量 例如 假定鲎试剂的标示灵敏度 为 0 125EU ml 样品的 MVD 为 100 倍 预试验结果表明样品在 1 8 倍稀释时 具有抑制作用 不干扰浓度 NIC 为 1 16 可选 择用于验证试验的稀释度或浓度为最低不小于 1 32 可以选择 1 64 4 方法学验证试验 增强 抑制试验 验证试验在细菌内毒素方法学的建立过程中具有十分重要的作用 主要目的是确证检测内 毒素的方法是否受样品的干扰 验证试验的特点是样品浓度保持不变 添加内毒素的浓度 逐渐降低 在建立细菌内毒素检查方法中 验证试验前 要去除样品可能含有的内毒素 以确保建立方法的准确可靠 凝胶法的验证试验是通过在细菌内毒素检查用水和样品溶液 中平行进行鲎试剂标示灵敏度的复核试验完成 试验中要求样品平行 4 管 设立样品阴性 对照管 也同样平行 4 管 尽管要求添加内毒素标准平行管数量各国不完全一致 可以 2 管 也可以 4 管 但鉴于目前国内的具体情况 在 2005 年版药典附录的细菌内毒素检查法 中规定是平行 4 管 细菌内毒素检查用水和样品溶液中的反应终点浓度的对数平均值 内 毒素含量 必须在鲎试剂标示灵敏度的 2 倍范围以内 在样品溶液和细菌内毒素检查用水 中的反应终点浓度的对数平均值也应相互在 2 倍范围之内 2 0 5 光度法的验证试 验中 要求阴性对照所含有的内毒素必须明显低于标准内毒素曲线中的最小浓度 阳性对 照的内毒素回收率 在扣除样品可能含有的内源性内毒素后 必须在已知添加内毒素量的 50 200 之间 添加和未添加内毒素的样品管数量至少要平行 2 管 二 细菌内毒素检查方法建立时注意事项及常见问题 1 在方法建立的过程中 对方法的验证非常重要 一个全面可靠的细菌内毒素检查法的方法学验证试验一般应注意 首先要了解产品的溶解 度 按照适当的临床用量确定合适的内毒素限值 并确证产品对方法是否存在干扰 如果 在样品处理过程中运用了激烈的处理条件或溶剂 还应证明所采用方法不会破坏或减少样 品中细菌内毒素含量 其次应考察样品批与批之间的差异是否会引起方法学变异 此外 还应注意实验中涉及到的试验器材对方法学的影响 如 器皿的控制 鲎试剂标示灵敏度 或光度法检测用鲎试剂的检测限 等 最后 要确保仪器的运行状态和对实验过程的准 确记录 总之 只有验证了整个实验的每一个环节 才能保证方法学的可靠和成功 方法 学验证终究是为药品生产质量服务的 验证本身也是一个动态的过程 是随着生产工艺 环境和检验条件改变而变化的 方法学验证实验记录 要抓住要点 将试验关键步骤记录 详细 避免验证资料照抄药典附录 罗列一大堆规定 最终没有明确的方法及可操作性 2 内毒素限值的确定十分关键 在细菌内毒素检查方法的建立中 计算内毒素限值 L MVD 和 MVC 时 需要注意最大人用剂 量 产品规格 鲎试剂的灵敏度等重要的参数 因为计算错误会导致后续的所有努力均告 失败 常见的问题有 1 临床用药剂量确定不正确 仅用常规用药剂量 未考虑临床可 能的人体最大用药剂量和给药途径 在限值计算公式 L K M 中 由于对 K 值及 M 值的定义 模糊 使 K 值及 M 值赋值不准确 最终导致限值计算错误 例如 某注射剂临床成人每次 静脉滴注给药 40 80mg 婴儿 三个月以上 静脉滴注给药每次 10 20mg 按成人 体重 60kg 剂量计算限值为 3 75EU mg 而婴儿体重仅为 5kg 左右 计算限值约为 1 25EU mg 如果不考虑临床每公斤体重最大用药剂量 细菌内毒素限值就会出现较大的差别 2 有 的申报品种细菌内毒素限值不是根据临床用量计算出来 而是根据同品种热原检查的剂量 推算出来的 造成限值错误 3 有的品种细菌内毒素限值从国外药典抄来 没有考虑该 品种国内上市的临床使用剂量及中国人与国外人均体重等的差异 也造成限值确定不正确 4 错误的计算日给药剂量 一日内多次给药 5 在品种规格 浓度 发生变化时 计算 MVD 没有进行调整 6 建立方法时所用的最大给药剂量已经超出了临床所用剂量等 3 在进行干扰试验预试验时不干扰浓度的确定方法不正确 对预试验的目的不理解 直接选用一个灵敏度的鲎试剂对应的 MVD 或 MVC 进行试验 如无 干扰则以该浓度为不干扰浓度 有的甚至直接选用高灵敏度的鲎试剂对应的浓度作为不干 扰浓度 未找到真正的不干扰浓度 使干扰试验失去意义 也有的申报单位仅选择 1 2 个 样品浓度进行试验 同样使试验缺乏完整性 4 供试品阳性溶液配制浓度 方法 不对 在使用简便方法配制供试品阳性溶液时 应将供试品溶液与细菌内毒素标准品溶液等量混 合 稀释 如 配制含 4 倍稀释供试品溶液的细菌内毒素标准品溶液 应使用 2 倍稀释供 试品溶液和 4 细菌内毒素标准品溶液等量混合 稀释 常见有的配制过程中直接使用 4 倍稀释供试品溶液或 2 细菌内毒素标准品溶液浓度等量混合 造成配制的供试品阳性溶 液中细菌内毒素标准品或供试品浓度低一倍 5 仅使用一个厂家的鲎试剂或一个批号的样品进行干扰试验 没有足够的代表性 2005 年版药典明确规定细菌内毒素检查进行干扰试验时 应同时使用两个以上厂家生产的 鲎试剂对至少三个批号的样品进行试验 但有的申报单位仅用一个厂家的鲎试剂或仅对一 个批号的样品进行试验 因为大部分注册药品其生产工艺 所使用的敷料等均不是很稳定 不同厂家生产的鲎试剂其抗干扰能力也不尽相同 因此仅用一个厂家的鲎试剂或仅对一个 批号的样品进行干扰试验 没有足够的代表性 确定的不干扰浓度可能在后续的试验中不 准确 6 错误认为一定要按最大有效稀释倍数 MVD 或最小有效浓度 MVC 进行试验 实际上 有的样品浓度很高也不干扰鲎试剂与内毒素的凝集反应 这种情况下 只要样品 内毒素含量合格 可以在 MVD 范围之内 即小于