掌跖脓疱病合并甲状腺腺瘤一例.docx

网址 第 1 页 共 4 页 原位杂交方法研究整合素 5 1 在硬皮病的表达 原位杂交方法研究整合素 5 1 在硬皮病的表达 中华皮肤科杂志 1999 年第 1 期第 32 卷 短篇论著 作者 洪微 廖万清 孔宪涛 李志刚 单位 洪微 廖万清 孔宪涛 李志刚 200003 上海 第二军医大学附属长征医院皮肤科 临床免疫中 心 硬皮病时以胶原为主的细胞外基质 ECM 合成异常增多的病理机制仍不清楚 真皮成纤维细胞 FB 是合成 ECM 的主要细胞 研究发现硬皮病局部存在着高产量胶原和其他 ECM 的异常 FB 亚群 但这种异常亚群的 激活机制及其表面分化抗原的特征均不清楚 近年来 发现 ECM 细胞间作用对调控细胞的迁移 趋化性 增殖 分化和特异性基因的表达具重要作用 而介导 ECM 细胞间作用的最主要受体是粘附分子整合素家 族 研究其在硬皮病中的表达特征对揭示硬皮病 ECM 合成过多的病理机制具有重要意义 我们运用原位杂 交方法研究了整合素 5 1 亚基在 20 例硬皮病皮损区的表达情况 并与非皮损部位及正常人皮肤进行 比较 一 材料与方法 1 病例 硬皮病患者 20 例 为 1995 年 1 月至 1996 年 12 月在本院皮肤科就诊的患者 均经临床及病理所 证实 其中男 7 例 女 13 例 年龄 9 46 岁 平均年龄 27 6 岁 病程 2 16 个月不等 其中 2 例局限性 硬皮病 18 例系统性硬皮病 正常人皮肤对照 20 例 男 8 例 女 12 例 年龄 12 40 岁 平均 25 2 岁 均为本院外科手术的非皮肤病患者 标本离体后半小时内液氮速冻 OCT 包埋 20 恒温连续切片 7 8 m 4 多聚甲醛固定 梯度酒精脱水后 70 保存 2 主要试剂 整合素 5 1 亚基质粒由美国 Human Genome Sciences INC 倪健博士惠赠 限制性内切酶 EcoR Xho 及 RNA 酶购自华美生物技术公司 鲑鱼精 DNA 多聚蔗糖 PVP 牛血清白蛋白 硫酸葡 聚糖 DEPC 为华顺生物技术公司产品 预杂交液配方参见文献 杂交液为预杂交液中加入相应探针 地高 辛标记试剂盒为 Boehringer Mannheim 公司产品 3 探针制备及标记 整合素 5 1 质粒的转化 鉴定 扩增 抽提及回收均参照文献 其序列长度分别 为 628bp 1020bp 探针标记采用地高辛试剂盒进行标记 随机引物法 并依据点杂交方法估计地高辛标 记探针的量 5 探针为 3ng L 1 探针为 5ng L 4 原位杂交 详细步骤参见文献 其中蛋白酶 K 浓度为 2 g mL 经预杂交 杂交后 参照地高辛标记试 剂盒说明书 加入标记生物素的抗地高辛抗体 进行显色反应 梯度酒清脱水 透明封片 显微镜下观察 结果 棕黄色或褐色为阳性 网址 第 2 页 共 4 页 二 结果 在真皮乳头层及真皮下层整合素 5 或 1 表达阳性的细胞呈散在或灶状分布 皮损部位阳性细胞明显多 于非皮损部位及正常皮肤 此外 在表皮 真皮的细胞间也可见整合素 5 1 分布 在放大 10 40 倍 光镜下 对每一标本任取 5 个不同的视野 在装有 10 10 的网格目镜测微器下计数每一方格 1cm 1cm 中 FB 平均阳性细胞数 阳性细胞密度 所得结果用 t 检验进行统计学分析 结果表明硬皮病皮损 5 1 亚基 mRNA 表达较非皮损区及正常人皮肤均显著增高 见表 1 表 1 硬皮病患者皮损 非皮损及正常人皮肤整合素 5 1 亚基表达的阳性细胞密度 分组 例数 整合素 5 整合素 1 阳性细胞浓度 t 值 P 值 阳性细胞浓度 t 值 P 值 硬皮病皮损组 20 66 2 8 5 6 868 0 01 76 0 9 8 网址 第 3 页 共 4 页 6 777 0 01 硬皮病非皮损组 20 16 2 2 0 3 967 0 01 18 5 2 1 2 065 0 05 正常人组 20 7 5 0 9 9 0 1 3 注 皮损与非皮损组比较 5 亚基 t 值 5 762 1 亚基 t 值 5 739 P 值均 0 01 与正常人组比较 三 讨论 硬皮病时 ECM 各成分发生了变化 而 FB 又是合成 ECM 的主要细胞 因此 ECM FB 间相互作用在硬皮病的 病理过程中尤为重要 本实验运用原位杂交技术检测到硬皮病皮损及非皮损区表皮及真皮 5 1 亚基 网址 第 4 页 共 4 页 mRNA 均有表达 真皮 FB 表面 5 1 亚基 mRNA 表达较非皮损区及正常皮肤均显著增高 提示纤维粘 连蛋白 Fn 与 FB 间粘附作用在硬皮病时增强 整合素 5 1 亚基作为连接 Fn 与 FB 细胞内骨架成分的 桥梁 其表达增多将通过细胞骨架成分的作用影响着 FB 的诸多生物学功能 最直接的效应就是细胞骨架 微管微丝收缩而导致 FB 游走 即对 FB 产生了趋化作用 Fn 对 FB 的趋化作用区即是 Fn 与 FB 发生粘附的 结合区 而趋化作用可能是硬皮病 FB 高产量胶原异常亚群激活的可能机制 这些作用可能涉及到整合素 的细胞内信号传导途径 国家自然科学基金资助 参 考 文 献 苏慧慈 原位杂交 第 1 版 北京 科学技术出版社 1994 73 74 147 149 J 萨姆布克 E F 弗里奇 J 爱尼阿蒂斯 分子克隆实验指南 金冬雁 等译 第 2 版 北京 科学技术出版社 1992 23 26 55 Lin CQ Bissel MJ Multi faced regulation of cell differentiation by extracelluar matrix FASEB J 1993 7 737 747 LeRoy EC Kahaleh MB Mercurio S A fibroblast mitogen present in scleroderma but not control sera inhibition by proteinase inhititors Rheumatol Int 1983 3 35