芦笋总皂苷含量测定的比色法研究

1 / 7芦笋总皂苷含量测定的比色法研究作者：赵建华， 宋擎， 汪素芳， 苏强， 张立伟【摘要】目的考察糖类、氨基酸及黄酮类物质对茴香醛-硫酸法测定芦笋总皂苷含量时的影响，并确定该法的最佳比色条件。方法选用菝葜皂苷元为对照品，采用茴香醛-硫酸法，在 429 nm 处测定糖类、氨基酸及黄酮类物质的吸光度，并利用正交实验设计优化比色条件。结果在 429 nm 处 3 类物质除黄酮类有较小的末端吸收外均无明显吸收，干扰较小。最优比色条件为样品挥干，加入 1%茴香醛无水乙醇溶液 ml，100水浴 30 min，冷却后测定。结论该法操作简便，干扰小，比色条件经济，可靠，便于实际应用。【关键词】 芦笋边角料 总皂苷 茴香醛-硫酸法 干扰因素考察 比色条件优化芦笋 Asparagus officinalis Linn.，学名石刁柏，为百合科天门冬属多年生草本植物，是一种药食两用的植物，其根茎入药，性苦，微辛，微温，功能温肺下气1，2 。成分分析表明，芦笋中含有游离氨基酸、维生素、微量元素硒等多种营养成分，以及甾体皂苷、多糖、黄酮类等药用成分3 ，具有极高的药用价值。现代药理学研究表明：芦笋提取物对多种癌细胞均有抑制作用，具有降2 / 7血脂、提高人体免疫功能、抗衰老等功能，其中，甾体皂苷为重要的物质基础4 。国内外文献报道，芦笋中含有多种甾体化合物，已分离得到 19 种甾体皂苷57 ，结构分析表明，芦笋皂苷多为螺甾皂苷，其苷元多为菝葜皂苷元4 。目前，植物总皂苷的含量测定主要为比色法，选用不同的显色体系，常见有乙酸酐-浓硫酸法、高氯酸法、浓硫酸法、香草醛-高氯酸法、香草醛-硫酸法、对二甲氨基苯甲醛法及茴香醛-硫酸法等 7 种。我们前期研究发现8 ，针对芦笋总皂苷的测定，综合考虑各因素的影响，茴香醛-硫酸法优于其它 6 种方法。基于茴香醛-硫酸试剂与螺甾皂苷的专属性反应，以菝葜皂苷元为对照品，考察了芦笋中几种常见物质：糖类(葡萄糖、蔗醣、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖)，氨基酸(半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、赖氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、异亮氨酸)及黄酮类(槲皮素、芦丁)对茴香醛-硫酸比色法9测定芦笋总皂苷含量的影响，并利用正交实验法优化了茴香醛-硫酸比色法的最佳比色条件，以期为进一步精确测定芦笋总皂苷含量奠定基础。1 仪器与材料仪器 HP 8453UV-Vis 吸收光谱仪；UNICO 7200 型3 / 7可见分光光度计尤尼柯仪器有限公司 ；BS110s 电子天平。材料茴香醛；菝葜皂苷元；芦笋总皂苷；槲皮素(中国药品生物制品检定所，批号 XX06)；芦丁(中国药品生物制品检定所，批号 020620)；所用单糖、双糖、氨基酸及其余化学试剂均为国产分析纯试剂。2 方法与结果茴香醛-硫酸法的干扰因素考察对照品溶液的制备精密称取菝葜皂苷元 5 mg，置于 10 ml 容量瓶中，用甲醇溶解，定容，吸取 1 ml 溶液稀释至 10 ml，即得。样品溶液的制备依次精密称取芦笋总皂苷、各种糖类、氨基酸、黄酮各 5 mg，分别置于 10 ml 容量瓶中，用甲醇溶解，定容，即得。显色溶液的制备吸取 8 ml 无水乙醇于 10 ml 容量瓶中，加入 1 ml 浓硫酸，摇匀，冷却至室温，加入 50 l茴香醛，无水乙醇定容，摇匀，即得。 测定方法分别精密吸取“”项下各溶液 1 ml，挥干溶剂，加入新鲜配制的茴香醛-浓硫酸乙醇液 ml，100水浴 15 min，取出冷却，加入无水乙醇 ml，茴香醛-浓硫酸乙醇液做空白，于 350800 nm 波长进行扫描，比较 34 / 7类物质对测定方法的影响。测定结果显示，在 429 nm 附近菝葜皂苷元和总皂苷均有明显吸收峰，糖类在此处均无明显吸收，说明糖类对茴香醛-浓硫酸法干扰很小；在同等条件下，15 种氨基酸在 429 nm 附近也均无明显吸收，且曲线均在基线附近，说明氨基酸对茴香醛-硫酸法基本没有影响。图 2 显示，两种黄酮在 429 nm 附近均有吸收峰末端，但吸收不是很大，说明黄酮类物质对茴香醛-硫酸法有一定的影响。茴香醛-硫酸法比色条件的优化正交实验法优选茴香醛-硫酸法比色条件设计 L9 正交表对显色剂浓度、反应时间、反应温度、显色剂体积 4因素进行考察。水平因素见表 1，测定结果及极差分析见表2，方差分析及最小二乘法分析结果见表 34。表 1 正交实验因素水平表表 2 正交实验测定结果及极差分析结果表3 正交实验结果方差分析表表 4 各因素水平最小二乘法平均值从分析结果的 R 值得出，4 因素对测定结果的影响顺序为反应温度显色剂体积反应时间显色剂浓度，最优显色条件为 A3B2C3D1，即 5%茴香醛无水乙醇液，吸取 ml，100水浴 30 min。查 F 值分布表可知，(2,2)=，(2,2)=，根据方差检5 / 7验判断标准，当 F 值大于小于等于时，该因素作用显著，记为“*” 。从表 3 得知，4 个因素的 F 值均大于(2,2)小于(2,2)，因此判定 4 个因素对实验影响均较为显著，根据 F值大小排序，可以看到 4 个因素的影响次序为反应温度显色剂体积反应时间显色剂浓度，其结果与极差分析结果相吻合。由表 4 中看到，取各因素最小二乘法平均值中的最大值，得到条件为显色剂浓度 5%，反应时间 30 min，反应温度 100，显色剂用量 ml，其结果与极差分析结果吻合。在实验过程中发现数据中 5%茴香醛乙醇溶液与 1%两个浓度的差别很小，且 5%对茴香醛用量较大，如果用 1%浓度代替 5%浓度，会大大节省显色剂用量，因此在进行最优工艺验证时，同时对 1%浓度条件进行了平行实验，以观察两种浓度的差异。最优比色条件验证精密吸取“”项下菝葜皂苷元溶液 1 ml 共 10 份，分别置于 10 支具塞试管中，挥干溶剂，试管从 110 标号，其中 15 号试管加入 5%茴香醛乙醇溶液 ml，610 号试管中加入 1%茴香醛溶液 ml，100水浴30 min，取出冷却，于 429 nm 下测定吸光度。结果见表5。表 5 最优比色条件验证结果对上表两组数据进行双样本 t 检验，结果 P=，表6 / 7明两组实验方差是一致的，两种浓度之间无显著差异。从测得的吸光度来看，两种浓度显色剂的吸光度值均超过了正交实验数据，符合正交实验结果。因此将显色剂浓度换为 1%茴香醛乙醇是可行的。这也从另一角度说明 1%的浓度已基本能够反应完全，而过量的茴香醛反而造成不必要的浪费。综上所述，最后确定茴香醛-浓硫酸法显色条件为 1%茴香醛无水乙醇溶液，吸取 ml，100水浴 30 min。3 结论考察了糖类、氨基酸及黄酮类对茴香醛-硫酸法测定芦笋边角料中总皂苷含量时的干扰10 ，在 429 nm 处菝葜皂苷元与芦笋总皂苷均有明显的吸收，而糖类和氨基酸几乎没有吸收，黄酮类有较小的末端吸收。结果说明，糖类和氨基酸对本法的干扰较小，黄酮类有一定干扰，为了准确测定芦笋中总皂苷含量，测定时可以考虑用差示分光光度法来扣除类黄酮物质的干扰。其余 6 种常见比色法的同步研究结果表明8 ，糖类对乙酸酐浓硫酸法、浓硫酸法及香草醛-高氯酸法影响较大、而 3 类物质对高氯酸法、香草醛-硫酸法及对二甲氨基苯甲醛法均影响较大，干扰明显。因此，茴香醛-浓硫酸法对总皂苷测定专属性要强于其余 6 种方法，另外，茴香醛法中，菝葜皂苷元与总皂苷在7 / 7测定波长 429 nm 处呈现明确的吸收峰，响应明显，通过数次重复实验，此吸收峰较为稳定，优于其余方法。 正交实验及极差分析表明，4 因素对测定结果的影响顺序为反应温度显色剂体积反应时间显色剂浓度，方差分析及最小二乘法分析均与上述结果吻合，最优比色条件为 A3B2C3D1，即 5%茴香醛无水乙醇液，吸取 ml