EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达与检测ppt课件.ppt

EGFP在E coli中的表达与检测3组 contents 第几章 一 背景介绍 1 绿色荧光蛋白 GFP 2 质粒3 大肠杆菌表达载体及表达系统4 SDS PAGE原理及蛋白分离与检测 1 绿色荧光蛋白 1 1 发现 下村修 马丁 查尔菲 钱学健 发现GFP 发光的遗传标签 科研 1 绿色荧光蛋白 GFP 1 1 发现 GFP的分子质量为26kDa 晶体结构如左图所示 蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构 长420nm 宽240nm 由11个围绕中心 螺旋的反平行 折叠组成 荧光基团的形成就是从该螺旋开始 桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖 底部由一个短的垂直片段覆盖 对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内 发色团是由其蛋白质内部第65 67位的 丝氨酸 酪氨酸 甘氨酸 自身环化和氧化形成 1 绿色荧光蛋白 GFP 1 2 特性 GFP在紫外光激发下发绿色荧光的最高吸收峰为395nm 另一小吸收峰为470nm 最大发射峰为505nm 1 绿色荧光蛋白 1 2 特性 1 绿色荧光蛋白 1 2 特性 优点 易于检测 荧光稳定 无毒害 通用性 易于构建载体 活细胞观察 1 绿色荧光蛋白 1 3 应用 2 质粒 2 1 pEGFP N3质粒 2 质粒 2 1 1 pEGFP N3质粒描述 pEGFP N3encodesared shiftedvariantofwild typeGFP 1 3 whichhasbeenoptimizedforbrighterfluorescenceandhigherexpressioninmammaliancells Excitationmaximum 488nm emissionmaximum 507nm pEGFP N3encodestheGFPmut1variant 4 whichcontainsthedouble amino acidsubstitutionofPhe 64toLeuandSer 65toThr ThecodingsequenceoftheEGFPgenecontainsmorethan190silentbasechangeswhichcorrespondtohumancodon usagepreferences 5 SequencesflankingEGFPhavebeenconvertedtoaKozakconsensustranslationinitiationsite 6 tofurtherincreasethetranslationefficiencyineukaryoticcells TheMCSinpEGFP N3isbetweentheimmediateearlypromoterofCMV PCMVIE andtheEGFPcodingsequences GenesclonedintotheMCSwillbeexpressedasfusionstotheNterminusofEGFPiftheyareinthesamereadingframeasEGFPandtherearenointerveningstopcodons SV40polyadenylationsignalsdownstreamoftheEGFPgenedirectproperprocessingofthe3 endoftheEGFPmRNA ThevectorbackbonealsocontainsanSV40originforreplicationinmammaliancellsexpressingtheSV40T antigen Aneomycinresistancecassette Neor consistingoftheSV40earlypromoter theneomycin kanamycinresistancegeneofTn5 andpolyadenylationsignalsfromtheHerpessimplexvirusthymidinekinase HSVTK gene allowsstablytransfectedeukaryoticcellstobeselectedusingG418 AbacterialpromoterupstreamofthiscassetteexpresseskanamycinresistanceinE coli ThepEGFP N3backbonealsoprovidesapUCoriginofreplicationforpropagationinE coliandanf1originforsingle strandedDNAproduction 2 质粒 2 1 2 pEGFP N3质粒应用 FusionstotheNterminusofEGFPretainthefluorescentpropertiesofthenativeproteinallowingthelocalizationofthefusionproteininvivo ThetargetgeneshouldbeclonedintopEGFP N3sothatitisinframewiththeEGFPcodingsequences withnointerveningin framestopcodons TheinsertedgeneshouldincludetheinitiatingATGcodon TherecombinantEGFPvectorcanbetransfectedintomammaliancellsusinganystandardtransfectionmethod Ifrequired stabletransformantscanbeselectedusingG418 7 pEGFP N3canalsobeusedsimplytoexpressEGFPinacelllineofinterest e g asatransfectionmarker 2 质粒 2 1 3 pEGFP N3质粒图谱 675bp 1394bp pEGFP N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP融合蛋白的质粒 它编码GFPmut1突变体 发生了两个氨基酸的替换 2 质粒 2 1 4 pEGFP N3的EGFP Leu Phe 64 Ser 65 Thr 荧光强度增加了35倍 2 质粒 2 1 5 编码EGFP的基因片段 675 1394bp长度720bp 651GCGGGCCCGGGATCCATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT700701CACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCC750751ACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAG800801CTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCC850851CACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACC900901CCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGC950951TACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGAC10001001CCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGC10501051TGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTG11001101GAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAA11501151GAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCA12001201GCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGC12501251CCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAG13001301CAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGA13501351CCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGC14001401CGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTT1450 2 质粒 2 2 pET28a质粒 2 质粒 2 2 1 pET28a质粒描述 ThepET 28a c vectorscarryanN terminalHis Tag thrombin T7 Tag configurationplusanoptionalC terminalHis Tagsequence Uniquesitesareshownonthecirclemap NotethatthesequenceisnumberedbythepBR322convention sotheT7expressionregionisreversedonthecircularmap Thecloning expressionregionofthecodingstrandtranscribedbyT7RNApolymeraseisshownbelow Thef1originisorientedsothatinfectionwithhelperphagewillproducevirionscontainingsingle strandedDNAthatcorrespondstothecodingstrand Therefore singlestrandedsequencingshouldbeperformedusingtheT7terminatorprimer Cat No 69337 3 2 质粒 2 2 2 pET28a质粒图谱 卡那霉素抗性 2 质粒 2 2 2 pET28a质粒图谱 3 大肠杆菌表达载体及表达系统 3 1 表达系统 常见的大肠杆菌表达系统如下 T7表达系统 T7噬菌体RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录 其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的35倍 Lac表达系统是 半乳糖甘酶编码基因lacZ的转录的调控序列 该启动子可以被IPTG诱导 所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达 Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子 其强度得到了很大的提高 也可被IPTG诱导 PL表达系统是负责 DNA分子转录的启动子之一 是一种很强的启动子 一个完整的大肠杆菌表达系统至少要由表达载体和宿主菌两部分构成 3 大肠杆菌表达载体及表达系统 3 2 大肠杆菌表达体系 大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点 易于生长和控制 用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵 有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择 在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化 磷酸化等翻译后加工 常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象 原核表达载体通常为质粒 典型的表达载体应具有以下几种元件 3 大肠杆菌表达载体及表达系统 3 3 原核表达载体 选择标志的编码序列 可控转录的启动子 转录调控序列 转录终止子 核糖体结合位点 一个多限制酶切位点接头 宿主体内自主复制的序列 3 大肠杆菌表达载体及表达系统 3 4 本实验表达系统 表达系统 3 大肠杆菌表达载体及表达系统 3 4 本实验表达系统 菌株内源的蛋白酶过多 可能会造成外源表达产物的不稳定 所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株 堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型 而BL21 DE3 就是一株由LacUV5启动子控制的T7噬菌体RNA聚合酶基因的溶源菌 pET28a是具有His标签 利用T7RNA聚合酶系统在大肠杆菌中诱导型高效表达外源蛋白的表达质粒 外源基因可与N端的His标签或者T7标签融合 以提高外源基因的表达量 3 大肠杆菌表达载体及表达系统 3 5 宿主菌的表达 4 SDS PAGE分离蛋白原理 4 SDS PAGE分离蛋白原理 第几章 二 实验流程 第几点 实验流程 大肠杆菌E coliDH5 阳性克隆转化BL21 DE3 IPTG诱导表达 SDS PAGE分离检测 第几章 三 实验步骤 第几章 扩增菌株提取质粒 EGFP基因的PCR扩增和回收 EGFP基因和pET28a载体的双酶切 pET28a EGFP重组表达载体的构建 EGFP基因的原核表达与检测 SDS PAGE凝胶电泳分离蛋白质 含pEGFP N3和pET 28a的大肠杆菌DH5 1 固 液接种 从LB平板上挑取含有以上质粒的E coliDH5 单菌落 接种于5mLLB培养基中 37 振荡培养过夜 2 液 液转接 以1 接种量将过夜培养的E coliDH5 接种于新鲜LB培养基中 37 220rpm振荡培养2 2 5h 1 扩增菌株及提取质粒 1 1 扩增菌株 1 取1 0 5 0mL的菌液 室温下13000rpm离心1min收集细菌 2 倒弃培养基 加入250 LSolution RNaseA混合液 涡旋振荡使细胞完全悬浮 3 往重悬混合液中加入250 LSolution 轻轻颠倒混匀4 6次 此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不超过5min 4 加入250 LSolution 温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀 5 室温下 13000rpm离心10min 6 转移上清液至套有2mL收集管的HiBindDNA结合柱中 室温下 13000rpm离心1min 倒去收集管中的滤液 7 把柱子重新装回收集管 加入500 LHBBuffer 按上述条件离心 弃去滤液 8 把柱子重新装回收集管 加入700 LDNAWashBuffer 按上述条件离心 弃去滤液 注意 浓缩的DNAWashBuffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释 9 弃去滤液 把柱子重新装回收集管 13000rpm离心空柱2min以甩干柱子基质 注意 不要忽略此步 这对去除柱子中残留的乙醇至关重要 10 把柱子装在干净的1 5mL离心管上 加入50 LElutionBuffer到柱子基质中 静置1 2min 13000rpm离心1min 洗脱出DNA 1 扩增菌株及提取质粒 1 2 提取质粒 pEGFP N3 pET28a 2 EGFP基因的PCR扩增和回收 2 1 EGFP基因的PCR扩增 引物设计 合适位点直接酶切还是PCR 2 EGFP基因的PCR扩增和回收 2 1 EGFP基因的PCR扩增 2 EGFP基因的PCR扩增和回收 2 1 EGFP基因的PCR扩增 2 EGFP基因的PCR扩增和回收 2 1 EGFP基因的PCR扩增 2 EGFP基因的PCR扩增和回收 2 1 EGFP基因的PCR扩增 EcoR 192 Hind 173 2 EGFP基因的PCR扩增和回收 2 1 EGFP基因的PCR扩增 2 EGFP基因的PCR扩增和回收 2 1 EGFP基因的PCR扩增 以pEGFP N3中的EGFP片段作为PCR反应的模板 设计引入EcoRI酶切位点的上游引物 5 GGA GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 3 和引入Hind 酶切位点的下游引物 5 一CCG AAGCTTGGCTGATTATGATCTAGAGTC 3 2 EGFP基因的PCR扩增和回收 2 1 EGFP基因的PCR扩增 产物5 GGAGAATTCATGGTG TCAGCCAAGCTTCGG 3 3 CCTCTTAAGTACCAC AGTCGGTTCGAAGCC 5 3 EGFP基因和pET28a载体的双酶切 3 1 酶切位点分析 选择重组酶切位点的3个原则 读码框正确不能破坏载体或目的片段两个酶缓冲液相似 从而可以同时酶切 EcoRIHindIII 3 EGFP基因和pET28a载体的双酶切 3 1 读码框分析 GAATTCATGGTG TCAGCCAAGCTTCTTAAGTACCAC AGTCGGTTCGAA 正常表达 未发生移码 2 EGFP基因的PCR扩增和回收 2 1 EGFP基因的PCR扩增 PCR反应体系 2 EGFP基因的PCR扩增和回收 2 1 EGFP基因的PCR扩增 PCR反应体系 2 EGFP基因的PCR扩增和回收 2 1 EGFP基因的PCR扩增产物的检验及回收 扩增产物经1 琼脂糖凝胶电泳检验后 用DNA纯化试剂盒回收后待用 1 用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来 称取质量 2 以0 1g凝胶对应300 L的体积加入溶胶液PN 50 水浴放置10min 其间不保持水浴温度不变并上下翻动离心管至胶完全融解 3 将上一步得到的溶液加入到吸附柱中 吸附柱放入收集管 室温静置1min 13000rpm离心30s 弃上清液 4 加入700 L漂洗液Pw 13000rpm离心60s 弃上清液 5 加入500 L漂洗液Pw 13000rpm离心60s 弃上清液 6 13000rpm离心2min 彻底除去漂洗液Pw 7 取出吸附柱 置于室温数分钟 彻底晾干 防止残留的漂洗液影响下一步的实验 8 将吸附柱放人一个干净的离心管中 在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB 洗脱缓冲液应先在65 水浴预热 体积应大于30 L 室温放置2min 13000rpm离心2min 9 然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中 重复步骤 8 10 经纯化回收的DNA置于 20 保存 3 EGFP基因和pET28a载体的双酶切 3 2 EGFP基因的双酶切 双酶切反应体系 37 保温1h65 条件下处理20min进行热失活经1 的琼脂糖凝胶电泳检验DNA纯化试剂盒纯化回收 3 EGFP基因和pET28a载体的双酶切 3 3 pET28a载体的双酶切 双酶切反应体系 经1 的琼脂糖凝胶电泳检验DNA纯化试剂盒纯化回收线性质粒条带 4 pET28a EGFP重组表达载体的构建 4 1 连接反应 连接反应体系 16 保温过夜 4 pET28a EGFP重组表达载体的构建 4 2 转化 感受态细胞的制备 1 固 液接种 从LB平板上挑取新活化的E coliDH5 单菌落 接种于5mLLB培养基中 37 振荡培养过夜 2 液 液转接 以1 接种量将过夜培养的E coliDH5 接种于新鲜LB培养基中 37 220rpm振荡培养2 2 5h 3 菌液冰浴 将菌液置于冰浴中 4 取两个无菌的1 5mL离心管 各加入1 5mL菌液 4 4000rpm离心5min 弃上清 重复上述操作 使每个1 5mL离心管中收集3mL培养液的菌体 5 残留液体涡旋细胞 加800 L预冷的0 1MCaCl2 冰浴悬浮细胞 4 4000rpm离心5min 弃上清 6 加入100 L预冷的0 1MCaCl2 轻轻悬浮细胞 冰浴20min 7 分装至50 L 管 感受态细胞制备完成 现用或者48h内使用 4 保存 4 pET28a EGFP重组表达载体的构建 4 2 转化 涂布平板 4 pET28a EGFP重组表达载体的构建 4 2 转化 筛选 37 平板培养过夜后 挑选3 5个菌落做PCR验证 进一步进行酶切鉴定 阳性克隆用于DNA测序 对经测序确证的 含pET28a EGFP重组质粒的菌落进行质粒提纯 5 EGFP基因的原核表达与检测 5 1 转化表达宿主 取1 L pET28a EGFP 重组表达质粒 转化至E coliBL21 DE3 感受态细胞 经37 培养过夜 5 EGFP基因的原核表达与检测 5 2 诱导表达目的基因 1 随机挑选10个阳性菌落克隆于含卡那霉素 50 g mL 的LB液体培养液中 2 37 摇床培养至OD值为0 4 1 3 取出3mL样品作为未诱导对照 4000rpm离心5min 收集细胞冻存于 20 4 剩下的样品继续加入100mMIPTG储液至终浓度为0 5mM 继续37 摇床培养 然后分别在日光灯和紫外灯下照射 6 SDS PAGE凝胶电泳分离蛋白质 样品的准备 制胶 电泳 染色 脱色 分析 6 SDS PAGE凝胶电泳分离蛋白质 6 1 样品的制备 1 将诱导表达后的菌体重悬于100 LPBS中 分别进行超声裂解 每个样品超声2 3s 处理2min 2 取超声后溶液适量留待制备菌体表达总蛋白质样品 4 12000rpm离心10min 分别获取超声上清和沉淀 然后超声上清 测蛋白质含量 调整浓度一致 超声离心后沉淀用适量PBS重悬 3 将菌体表达的总蛋白样品 超声上清 超声沉淀各取20 L与5 样品缓冲液在EP管中混合 放入100 加热5min 4 常温离心10000rpm 取适量上清准备上样 6 SDS PAGE凝胶电泳分离蛋白质 6 2 分离胶及浓缩胶的制备 分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备 先制分离胶 将分离胶注入玻板后 用去离子水封口 约30 40min后凝聚 将胶面的水吸干后灌注浓缩胶 并插入梳子 胶凝固后即可 分离胶去离子水3 5mL4 分离胶缓冲液 pH 8 8 2 5mL丙烯酰胺储液 30 4mLTEMED10 L10 AP80 L 浓缩胶去离子水2 3mL4 浓缩胶缓冲液 pH 8 8 1mL丙烯酰胺储液 30 0 67mLTEMED10 L10 AP50 L 6 SDS PAGE凝胶电泳分离蛋白质 6 3 凝胶电泳 取80ml电极缓冲液稀释5倍后 分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中 然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品 80V恒压20min 120V恒压2h 6 SDS PAGE凝胶电泳分离蛋白质 6 4 染色 脱色 取电泳完毕 剥胶后 在摇床上染色0 5 1小时 之后 在脱色液中脱色1h 观察目的蛋白表达情况 第几章 四 预期结果 1 菌落PCR的结果2 重组质粒的双酶切结果3 测序的结果4 EGFP基因的表达结果5 分生实验课上的实验结果 第几点 1 菌落PCR的结果 PCR产物经1 琼脂糖凝胶电泳后 可发现在靠近750bp处有清晰条带 这便是阳性 第几点 2 重组质粒的双酶切结果 进一步对阳性菌落中的质粒进行提纯 用EcoRI和Hind 对质粒进行双酶切 经1 0 琼脂糖凝胶电泳后 可在靠近750bp处看到目的片段的条带 第几点 3 测序结果 将PCR进行测序 正确结果应该与genebank序列完全一致 由此可以证明目的片段 EGFP 已正确连接到pET28a表达载体 并且核苷酸序列未发生任何碱基突变 第几点 4 EGFP基因的表达结果 加入IPTG诱导后 可观察到菌体细胞呈现绿色如图所示 说明目的基因在表达菌E coliBL21中表达 如图所示在紫外光下可以观察到菌体细胞发绿色荧光 第几点 5 分生实验课上的实验结果 在6月5日 10日和12日的分生实验课上 我们进行了 EGFP DsRed和YFP在E coli中的诱导表达和检测 的实验 得到了一些实验结果 现进行实验结果分析如下 第几点 5 分生实验课上的实验结果 在本次实验中 我们向LB固体培养基平板中进行接种的表达菌株分别可以表达GFP基因 RFP基因和YFP基因 从而经过IPTG诱导后可以产生相应的荧光蛋白 6月10日下午我们在平板上进行划线接种 接种工具可以使用灭菌后的牙签 棉棒以及灼烧后的接种环 我对两个平板进行接种 其中一个平板接种后的图案如下图所示 图中可以很明显地看出平板划线的痕迹 接种完成后将平板倒置放在37 恒温培养箱中培养 第几点 5 分生实验课上的实验结果 6月12日下午我们从恒温培养箱中取出平板观察实验结果 观察发现 在我做的2个平板中 表达菌株在平板中生长状态良好 在日光下就可以看到平板上的绿色 红色和黄色的菌落颜色 实际上是大肠杆菌产生的荧光蛋白的颜色 其中一个平板在6月10日接种了可以产生RFP的表达菌株 6月12日观察发现该平板在日光灯下即可见红色菌落组成的图案 如下图所示 第几点 5 分生实验课上的实验结果 不过该平板不小心被捏碎 导致没有在紫外灯下观察和拍照 我只对另一个平板在紫外灯下进行观察和拍照 实验结果如下图所示 第几点 5 分生实验课上的实验结果 上图所示的平板中我只接种了可以产生GFP的表达菌株 从而在平板中可以产生绿色菌落 该平板在日光灯下便可见绿色菌落 在紫外灯下观察更加明显 在紫外灯的照射下 平板中的菌落发出绿色荧光 非常明亮 可以清晰地看到平板中的图案 在6月10日的平板划线过程中 我花了很多时间对第一个平板进行划线接种 第二个平板只是简单地划线接种 但是很不巧的是6月12日第一个平板被捏碎导致没有在紫外灯下观察拍照 因此最终的实验结果只能呈现第二个平板图案 第二个平板的图案设计没有什么独特的地方 设计该图案的原因是我们宿舍有一个舍友叫邱伟 外号是伟哥 他的口头禅是 厉害 因此我就随手在平板上写下了 伟哥厉害 四个字 第几点 5 分生实验课上的实验结果 6月12日我们同时对GFP RFP和YFP三种蛋白质进行SDS PAGE电泳检测 SDS PAGE电泳的加样顺序如下面两表所示 第几点 5 分生实验课上的实验结果 SDS PAGE电泳结果如下所示 第几点 5 分生实验课上的实验结果 第几点 5 分生实验课上的实验结果 泳道4和泳道11中加的是marker 其SDS PAGE电泳理论条带如右图所示 电泳后的marker中有7条带 指示的蛋白质大小分别是14 4kDa 18 4kDa 25 0kDa 35 0kDa 45 0kDa 66 2kDa和116 0kDa 在电泳图 1 和 2 中两个marker跑出的条带都较清晰 可以看到marker中7条指示条带 电泳效果较好 泳道12 泳道13 泳道1 泳道14加的是空载体pET28a分别培养0小时 1小时 3小时和5小时后的样品 从SDS PAGE电泳图 1 和 2 中可以看到 这4个泳道中有若干条条带 这些条带的位置和亮度相近 都是表达载体自身的蛋白质电泳结果 在这三种荧光蛋白对应的条带位置处没有观察到相应的条带 说明不含荧光蛋白基因的表达载体无法产生荧光蛋白 第几点 5 分生实验课上的实验结果 泳道2 泳道3 泳道5和泳道6加的是可以产生GFP的表达菌株分别经IPTG诱导0小时 1小时 3小时和5小时后的样品 GFP的分子质量为26kDa 处于marker25 0kDa和35 0kDa两条条带之间 即marker从下往上数第3 4条带之间 理论上可以产生GFP的表达菌株经IPTG诱导的时间越长 产生的GFP越多 电泳后得到的GFP对应的条带越亮越宽 从图中可以很明显地看出 泳道2中的电泳条带与泳道1等导入空载体pET28a表达菌株的电泳条带相同 没有观察到GFP对应的条带 说明没有经IPTG诱导表达的表达菌株不能产生GFP 泳道3 泳道5 泳道6中均有符合GFP对应条带位置的又宽又明亮的条带 而且条带宽度增加亮度增加 这说明经IPTG诱导表达时间越长 表达菌株产生的GFP越多 第几点 5 分生实验课上的实验结果 泳道8 泳道9 泳道10和泳道7加的是可以产生RFP的表达菌株分别经IPTG诱导0小时 1小时 3小时和5小时后的样品 RFP的分