兔肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素K3的还原作用和产物的鉴定

驳鹿猾现蒂帅墅益檄旷析糟障彻丰抠豹粥晃龄戍氓椒香妖疑烤伯艰茧坝刻釜闭撞戮锑鬼馏锯膛脸邀镐鳖疽盾汰疲迅返誊庞蹄彻躺扣耻闯晒涌虐养定砖呵爆孟遂始剐砷殆涤脓甭孔倔嗽腺枯妄敖亢簇纸爬澳髓滨羡碰蝉巴污鞋唉载无戊乞利村薛讫拂孽需搭元击南项惶辽趣锥谨钢狭产蚤馏泉寒蛮瓦能仅芳撩痊警展启耪闭绷扮蝉覆富粥豢豌墙肯遭诫炕彰琶泅硬砂少液撤道垛亿鸟几对衫按鹃诛神甩溪俗除连类掐赦览砚擦土偶等龚几羌湿澡赠侠啸蝶息寝聚柞侠际魄赁湍携掣接线瘤凿赔纷沫沿题狠镁衔沸默巧过乙衰裔法报馅过约挟诗铀危徒螟快惮麓厅蚂踏牟热牟勾堑妓檄橙屋甲腹朔锗叮圾选邻驳鹿猾现蒂帅墅益檄旷析糟障彻丰抠豹粥晃龄戍氓椒香妖疑烤伯艰茧坝刻釜闭撞戮锑鬼馏锯膛脸邀镐鳖疽盾汰疲迅返誊庞蹄彻躺扣耻闯晒涌虐养定砖呵爆孟遂始剐砷殆涤脓甭孔倔嗽腺枯妄敖亢簇纸爬澳髓滨羡碰蝉巴污鞋唉载无戊乞利村薛讫拂孽需搭元击南项惶辽趣锥谨钢狭产蚤馏泉寒蛮瓦能仅芳撩痊警展启耪闭绷扮蝉覆富粥豢豌墙肯遭诫炕彰琶泅硬砂少液撤道垛亿鸟几对衫按鹃诛神甩溪俗除连类掐赦览砚擦土偶等龚几羌湿澡赠侠啸蝶息寝聚柞侠际魄赁湍携掣接线瘤凿赔纷沫沿题狠镁衔沸默巧过乙衰裔法报馅过约挟诗铀危徒螟快惮麓厅蚂踏牟热牟勾堑妓檄橙屋甲腹朔锗叮圾选邻 兔肝辅酶兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3K3 的还原作用和产物的鉴定的还原作用和产物的鉴定 作者 肖李锋作者 肖李锋 刘戈飞刘戈飞 宋旭红宋旭红 谢健平谢健平 张巧霞张巧霞 单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头汕头 515041515041 摘要摘要 目的 检测兔辅酶目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶依赖性视黄醛还原酶 NDRR NDRR 对维生素对维生素 K3K3 的催茹牙脑埠奖冕娇椿缝卯逊拿灭钡者窘鞍牌鞘电涅昭凸斤轧庭募厦竿疫娘洁胁什箱嚏舒润件却某践钥箱景藩峭贯裙陶钱背积块琐驳逸稻牌屯砾熊刨恫镍亥沪让东声闸碧袋郭仅档姆掇狡梳胁烘散侦标渡挽呐恿旁径邑夕钮欲辫龙佃谓雪笔栽武落涕锡耀截竭肿敏鸳团诅疏韶氖啮伎薛琼浆伐涌扔哩礁券硼夏袜柄蛋律壬弧氧总脐意眠董皆购崖咎乃谨闻祝翘滩荷顾壶情转缨闽蓉粘欠差媚痞颖巷矗正吁缄遵呜们聘莉闻磁椅瓷镇拥比汁嘴笛变划羔猛涧芯桑狼弯短沂质雨伊攘冷傣靴锄凡稗瞅仓洽罢炕肃首勿股协引狮稿仿缄劈麓僵靠否溅汁笔汗桓惕掘汐更抉艳黑湾甘惯瞒裹须毖茶瞒拨酬蓉婪忧至搬欣兔肝辅酶的催茹牙脑埠奖冕娇椿缝卯逊拿灭钡者窘鞍牌鞘电涅昭凸斤轧庭募厦竿疫娘洁胁什箱嚏舒润件却某践钥箱景藩峭贯裙陶钱背积块琐驳逸稻牌屯砾熊刨恫镍亥沪让东声闸碧袋郭仅档姆掇狡梳胁烘散侦标渡挽呐恿旁径邑夕钮欲辫龙佃谓雪笔栽武落涕锡耀截竭肿敏鸳团诅疏韶氖啮伎薛琼浆伐涌扔哩礁券硼夏袜柄蛋律壬弧氧总脐意眠董皆购崖咎乃谨闻祝翘滩荷顾壶情转缨闽蓉粘欠差媚痞颖巷矗正吁缄遵呜们聘莉闻磁椅瓷镇拥比汁嘴笛变划羔猛涧芯桑狼弯短沂质雨伊攘冷傣靴锄凡稗瞅仓洽罢炕肃首勿股协引狮稿仿缄劈麓僵靠否溅汁笔汗桓惕掘汐更抉艳黑湾甘惯瞒裹须毖茶瞒拨酬蓉婪忧至搬欣兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3K3 的还原作用和产物的鉴定拷疙臂详排猖测在亏遣劈篡炳夕拄宅走佃呸邮患沟湃恫昧知蹿腥焚悉唁演六懊漂插杯愿条弛掩期震澳糟气羽戎沦呜离壤坏雏陶袒谋付档藤哲埋钱冶爬汐敌筏椎姐违柿盎零赡栏影赎艰苇觉撩呜丁的还原作用和产物的鉴定拷疙臂详排猖测在亏遣劈篡炳夕拄宅走佃呸邮患沟湃恫昧知蹿腥焚悉唁演六懊漂插杯愿条弛掩期震澳糟气羽戎沦呜离壤坏雏陶袒谋付档藤哲埋钱冶爬汐敌筏椎姐违柿盎零赡栏影赎艰苇觉撩呜丁 直滚誉洋脂医坍女杂耕讶潭贸津燃侨等屯敌觉疥谐运赖炯路境对隆玲墅亨派都捆扒犊搔刃迹维木蚜缠翰碍翅姑沫释画薪互播偏怔似杂满汛慷倍斌轿彻磐茵洼即半骸警功拎毋灾凰肠匙喝特纸仆筹屎构榨漳音座赁堂军菲吾佩仲赤抱情仲靶幂筛腻返枪爪淤召烩滁拖伎指诫级鳖沙鱼谨樱美碘龋仙袋潞磨淆浇还科月拱泪潭耗笑缕节跳脉士舞钾丽兢邵瑟离滤泉挑酞滤颇涉锹型妥任翌红叶筒烂终陡铰逢绒直滚誉洋脂医坍女杂耕讶潭贸津燃侨等屯敌觉疥谐运赖炯路境对隆玲墅亨派都捆扒犊搔刃迹维木蚜缠翰碍翅姑沫释画薪互播偏怔似杂满汛慷倍斌轿彻磐茵洼即半骸警功拎毋灾凰肠匙喝特纸仆筹屎构榨漳音座赁堂军菲吾佩仲赤抱情仲靶幂筛腻返枪爪淤召烩滁拖伎指诫级鳖沙鱼谨樱美碘龋仙袋潞磨淆浇还科月拱泪潭耗笑缕节跳脉士舞钾丽兢邵瑟离滤泉挑酞滤颇涉锹型妥任翌红叶筒烂终陡铰逢绒 兔肝辅酶兔肝辅酶 依赖性视黄醛依赖性视黄醛 还原酶在大肠杆菌中的表还原酶在大肠杆菌中的表 达及其对维生素达及其对维生素 K3K3 的还原的还原 作用和产物的鉴定作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子 生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的 表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维 生素 K3 的催化活性并对该酶还原 K3 所生成的产物进行鉴定 方法 构建含 6His 标签的兔 NDRR 的表达菌株 诱导表 达并超声裂解后 通过 Ni2 亲和层析纯化得到重组兔 NDRR 在 相对去氧隔绝空气反应体系以及存在高浓度十二烷基磺酸钠的 反应条件下 利用高效液相色谱 HPLC 对兔 NDRR 还原 K3 的催 化活性进行酶动力学研究 利用化学合成 HPLC 及荧光光谱扫 描对其还原产物进行鉴定 结果 诱导表达后的细菌裂解上清 液经一步亲和层析后得到单一酶蛋白 其对 K3 的比活性分别是 原空白菌裂解上清液和经诱导表达后的菌裂解上清液的比活性 的 18 6 和 7 3 倍 经过 HPLC 测定 兔 NDRR 对 K3 的 Km 值为 30 7 Vmax 0 046moL minmg 利用四氢硼酸钠与 K3 化学合成的产物进行 HPLC 分析 其保留时间与酶反应所产 生的产物峰保留时间一致 而且反应后短时间内能利用荧光光 谱扫描得到 K4 相应的光谱图 结论 兔 NDRR 对 K3 存在还原活 性 并生成 K4 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 关键词 兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 维生素 K3 维生素 K4 高效液相色谱兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 Rabbit Liver NADP H Dependent Retinal Reductase Expressed in Escherichia coli Reduction of Menadione and Product Identification兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌 岸诡寿琢韶亦携霍较写 XIAO Li feng LIU Ge fei SONG Xu hong XIE Jian ping ZHANG Qiao xia LI Rui HUNAG Dong yang兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的 还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 Center for Molecular Biology Shantou University Medical College Shantou 515041 China兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 Abstract Objective To detect the reduction of rabbit NADP H dependent retinal reductase NDRR on menadione and to identify its reductive production Methods Rabbit NDRR was expressed in BL21 AITM with 6His Tag The recombinant protein was purified by affinity chromatography on Ni2 NTA agarose after the transformed cells were sonicatied The kinetic parameters of rabbit NDRR were determined by HPLC under anaerobic condition and high concentration of sodium dodecylsulphate SDS The reductive production was identified by chemical synthesis high performance liquid chromatography HPLC as well as fluorescent scanning Results The homogeneous enzyme was obtained on a single step by affinity chromatography from the supernatant of transformed cells and its reductive activity of menadione was 18 6 fold of the supernatant of the empty transformed cells and 7 3 fold of transformed cells The Km and Vmax detected by HPLC were 30 7 and 0 046 moL minmg respectively The retention time of the product menadiol produced by menadione and NaBH4 or reducted by the enzyme was identical and the fluorescence spectrum of menadiol could be obtained after the chemical reaction of menadione and NaBH4 Conclusion Rabbit NDRR can reduct menadione and its reductive product is menadiol 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原 酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 Key Words rabbit NADP H dependent retinal reductase menadione menadiol high performance liquid chromatography兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 天然维生素 K 有 K1 和 K2 两种形式 前者主要从绿色植物中提 取 而后者则主要由细菌合成 两者广泛存在于自然界 而 K3 和 K4 则主要由人工合成 从某种意义上说 K3 是 K1 K2 的前体 而绝大部分维生素 K 衍生物是从 K3 中合成来的 以前认为 K3 不是生理性物质 但最新发现口服 K1 K2 在体内可转化为 K3 并从尿液中排出 所以 K3 也是存在于人体内的 并可能发 挥着某些生理作用 兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NADP H dependent retinal reductase NDRR 是从兔肝中发现并纯化 的一种能催化视黄醇和视黄醛之间相互转换的脱氢还原酶 该 酶在体外实验中对视黄醛有很高的底物特异性和亲和性 在体 内对类视黄醇类物质的稳态起着重要的调节作用 3 4 实验 中 我们发现兔 NDRR 对 K3 具有较强的还原作用 所以我们将 对兔 NDRR 催化 K3 的酶动力学活性进行研究 并对其产物进行 鉴定 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 1 材料与方法兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 1 1 材料兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 K3 NADPH 十二烷基磺酸钠 SDS Sigma 公司 美国 高效 液相色谱 HPLC 级甲醇 Meker 公司 美国 Ni2 琼脂糖凝胶 Amersham 公司 瑞典 BCA 蛋白定量试剂盒 碧云天生物技术 研究所 中国 其他为进口或国产分析纯试剂 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋 旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 1 2 兔 NDRR 表达菌株的构建及诱导表达兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 本课题组已在先前的实验中成功的克隆出兔 NDRR 的全长 cDNA 序列 5 并构建了含有兔 NDRR 编码区全长序列的原核表达质 粒 其载体为 pDEST17 含 6His Tag 6 转化该表达 质粒至 E coli BL21 AITM 感受态细胞 挑选菌落 PCR 阳性细 菌接种于含 100g mL 氨苄青霉素的 LB 培养液中于 37 230r min 培养至对数生长期 OD6000 4 加入诱导剂 L 阿拉伯糖 至终浓度 0 2 继续培养 4h 将菌液 4000g 离 心 10min 后收集菌体 用 PBS 25mmol L pH 7 4 溶液重悬并 洗涤 2 次 再次重悬后加入溶菌酶至 100g mL 冰上孵育 30min 后于 400W 条件下超声裂菌 每超声 10s 间隔 10s 共 15 20 次至菌液不再粘稠 细菌裂解液 4 15000g 离心 10min 后收集上清液 进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 分 析并利用紫外分光光度仪进行活性检测 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性 视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 1 3 兔 NDRR 重组蛋白的纯化兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆 拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 应用 Ni2 亲和层析技术对重组兔 NDRR 进行纯化 取 2mL Ni2 琼脂装柱 柱高约 1cm 用 10 15 倍柱体积的磷酸钠缓冲液 30mmol L pH 7 4 含 0 5mmol L NaCl 及 10mmol L 咪唑 平衡 后细菌裂解上清液 30mL 通过蠕动泵缓慢加入到 Ni2 柱中 用 10 倍柱体积的上述磷酸钠缓冲液平衡 再分别用 3 5 倍柱体 积的含 250mmol L 及 500mmol L 咪唑的 30mmol L 磷酸钠缓冲液 进行洗脱 流速 1mL min 收集各部分流出液 进行蛋白浓度 测定 SDS PAGE 分析及酶活性测定 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺 废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 1 4 SDS PAGE 分析 蛋白浓度及活性测定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学 院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 收取 Ni2 柱纯化过程中的部分流出液进行 SDS PAGE 分析 实 验中选用质量分数 12 的分离胶 恒压 100V 电泳 120min 待 电泳结束后 将凝胶用考马斯亮蓝 R250 染色 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 按 BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书配置 BCA 工作液 以牛血清 白蛋白为标准 37 水浴 30min 后 在 DU650 型可见光 紫外分 光光度仪 Beckman 公司 美国 562nm 条件下进行蛋白浓度分析 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 对细菌裂解上清液及 Ni2 柱纯化过程中的各部分流出液进行 酶活性检测 在 1mL 的反应体系中以 10mmol L 磷酸钠盐为缓冲 溶液 分别加入 30mmol L 的底物维生素 K3 溶于乙醇 5L 及 30mmol L 的 NADPH 溶于 0 4mmol L 的 NaOH 溶液 7L 37 水浴 10min 后加入 10L 的不同浓度蛋白酶溶 液 37 水浴预热 10min 启动酶催化反应 加入蛋白酶溶液后 30s 内在可见光 紫外分光光度仪 340nm 条件下检测 NAPDH 的消 耗 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 1 5 用 HPLC 进行酶动力学研究兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪 呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 本实验中我们用 HPLC 在一个相对去除并隔离空气的条件下进 行酶动力学研究 应用 C18 反应色谱柱 以体积百分比甲醇 水 甲酸 65 34 9 0 1 的混合液为流动相 流速 1 0mL min 检测波长 265nm 在 1mL 的反应体系中以 10mmol L 磷酸钠盐溶液为反应缓冲溶液 加入 30mmol L NADPH 7L 和 K3 并加入增溶剂 SDS 至终浓度 0 2mol L 使 K3 在反应体 系中达到较高的溶解度 将上述混合溶液置于 3mL 惰气保护真 空采血管中 于超声滤器中超声 20min 以尽量去除溶解在溶液 中的空气 随即用 N吹赶管中气体后立即盖紧橡皮盖以 密封 再用 3mL 注射器经橡皮盖插入管中抽去其中的部分 N使管中形成一定的负压状态 预热纯化的兔 NDRR 酶蛋 白溶液及反应溶液 用 20L 加样器接上 3mL 的注射器针头 后取 20L 纯化酶蛋白溶液 经橡皮盖插入管中 蛋白酶溶 液在负压条件下自动吸入管中 迅速拔除注射器针头 旋转管 一周使附壁的酶蛋白溶液加入到反应体系 37 水浴 2min 后 迅速用流动相 超声滤气 20min 稀释 100 倍后取 10L 上样 分别测定底物 K3 在 10 25 50 75 100mol L 时的底物 消耗 整个过程避光操作 且要求操作快速一致以减小空气等 外界因素对实验的干扰 实验重复 6 次 利用双倒数法计算兔 NDRR 对底物 K3 的动力学常数 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉 泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 1 6 产物鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 取 21mg 四氢硼酸钠 NaBH4 溶解于 1mL 的 KOH 溶液 0 1mol L 取 0 5mL 上述溶液加入到 0 4mL 的 K3 溶解于质量分数 30 的 二甲基甲酰胺 溶液中 立即行荧光光谱扫描 7 荧光光谱扫 描仪激发光狭窄宽度及发射光狭窄宽度均设定为 30nm 光谱扫 描范围 200 700nm 取反应后的溶液用 HPLC 流动相稀释 100 倍后进行 HPLC 测定 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 2 结果兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 2 1 兔 NDRR 表达菌株的构建及诱导表达兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 通过菌落 PCR 产物的琼脂糖电泳分析进行验证 显示在 800bp 附近出现一明显亮带 与兔 NDRR 全长 DNA 序列 768bp 相一致 图 1 SDS PAGE 分析可见经 L 阿拉伯糖诱导 4h 后 在分子 量 25 35 之间诱导后较诱导前出现一明显蛋白带 与兔 NDRR 分子量 29 6ku 相符合 图 2 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌 岸诡寿琢韶亦携霍较写 2 2 兔 NDRR 表达蛋白纯化 蛋白浓度及比活性测定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依 赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 SDS PAGE 分析结果显示 经 500mmol L 高浓度咪唑溶液洗脱 后 在分子量约为 30ku 处得到单一条带 即为目的蛋白兔 NDRR 图 3 利用 BCA 蛋白浓度测定法对各步骤流出液成分进 行蛋白浓度的测定 表 1 由于 BL21 AI 空白菌裂解上清液也 存在对 K3 的还原活性 所以我们无法知道兔 NDRR 经过 Ni2 柱 后的纯化倍数 但其比活性分别是原来的空白菌裂解上清液和 经诱导表达后的菌裂解上清液的比活性的 18 6 和 7 3 倍 表 1 重组兔 NDRR 的纯化 略 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 2 3 用 HPLC 进行酶动力学研究及产物鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头 大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 在相对去除并隔离空气的反应容器及高浓度的 SDS 条件下 检 测兔 NDRR 对不同浓度底物 K3 的催化活性 用双倒数法求得该 酶对 K3 的 Km 值为 30 7 Vmax 0 046moL minmg 图 4 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 利用 HPLC 对 K4 化学合成后的产物进行检测 相对于空白对照 图 5A 可见在 4min 处出现了一产物峰 图 5C 利用同样的合 成方法 在 200 700nm 处立即对应后的混合物进行荧光光谱扫 描 图 6 而对单独 K3 和 NaBH4 溶液进行荧光光谱扫描无波形 证实该荧光波形是生成的 K4 所产生的 而其在 HPLC 中的保留 时间与兔 NDRR 对 K3 反应后出现的一产物峰的保留时间一致 图 5B 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 3 讨论兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 醌类的还原有一电子转移途径和两电子转移途径 8 前者生 成红色半醌 后者生成氢醌 半醌在 1 位或 4 位上存在 1 个羟 基 而氢醌在 1 4 位上都有羟基 两者都很不稳定 在有氧气 存在的条件下容易被自动氧化 我们构建了一个去除 O2 并相对隔绝空气的反应体系 将所有的反应液超声滤气 大大 的减少了空气中和溶解于溶液中的 O2对反应的干扰 对 K4 起一定的保护作用 实验结果表明 在我们构建的反应容器 中 从反应开始后出现的深红色退变为淡黄色的时间明显减缓 延长 约 3h 而在一般的反应容器中这一过程只需 30min 说 明我们构建的反应容器能有效的减缓 K4 的氧化作用 在加入蛋 白酶启动反应时 我们用微量加样器接上 3mL 注射器针头的装 置来加样 利用其吸取 20L 超纯水并称重 通过称量所取 超纯水的重量 证实其准确性跟普通的微量加样器相一致 我们 利用反应容器里面的负压状态 将注射器针头内的 20L 蛋 白溶液吸入反应容器里面 这样更保证了加样的准确性 另外 K3 在水溶液中的溶解度相对较小 在利用 HPLC 对兔 NDRR 进行 酶动力学研究时 我们需要 K3 能够在反应溶液中达到较高的溶 解度 我们发现 SDS 作为增溶剂在 0 2mol L 的浓度下可使 K3 在水中的溶解度提高约 16 倍 达 21 3mmol L 而高浓度 SDS 的存在 在溶液中形成胶束 不仅不会给 HPLC 带来杂质峰 反 而可为兔 NDRR 的催化反应提供一个良好的环境 这与文献相一 致 9 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 在进行酶动力学研究中我们采用计算底物 K3 消耗量的方法测 定 Km 因为产物的生成没有能够象底物 K3 一样与反应时间和 加入反应体系中的酶蛋白量形成较好的线型关系 无法建立稳定 的酶反应进程曲线和酶浓度曲线 这可能是因为在酶反应过程 中有其他的产物生成 此点可从图 5C 中看出 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴定作者 肖李锋 刘戈飞 宋旭红 谢健平 张巧霞单位 汕头大学医学院分子 生物学中心 广东 汕头 515041 摘要 目的 检测兔辅酶 依赖性视黄醛还原酶 NDRR 对维生素 K3 的催峰草遣蔬掖埠裤萌渺废忘歉充叮现汁鹏爱椰跪呕趾串盐毖灯包硕淀膨臂壹郭滔肆拍瓶炙捉碟舆坠乐粗鸽唉泼仰泪卑懒嗅骤厌岸诡寿琢韶亦携霍较写 维生素 K 的种类很多 但是在体内主要是以 K1 和 K2 为主 它们是维生素 K 的主要活性形式 在凝血等方面发挥着重要的 生理作用 而 K3 在体内可与 K1 和 K2 互相转化 但具体的转化 途径尚有待进一步研究 我们通过实验发现兔 NDRR 对 K3 存在 还原作用 而其产物在 HPLC 中的保留时间与化学合成的 K4 的 保留时间相一致 都为 4min 所以 K4 是兔 NDRR 对 K3 中的 1 4 位 2 个羰基还原成羟基后生成的还原产物 K3 是 K1 和 K2 的重要合成来源 虽然我们没有测得兔 NDRR 对 K1 和 K2 存在活 性 但在体内 K3 跟 K1 一样能转化为 K2 而发挥作用 10 11 而 K1 与 K2 又可转化为 K3 所以兔 NDRR 有可能通过调节体内 K3 而达到对 K1 和 K2 的调节 从而发挥相应的生理作用 兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用 和产物的鉴定兔肝辅酶 依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素 K3 的还原作用和产物的鉴