苜蓿总皂苷提取物抗动脉粥样硬化和降血脂的实验研究

1 / 10苜蓿总皂苷提取物抗动脉粥样硬化和降血脂的实验研究作者：邴飞虹，程静，冯新刚，万敏，韩俊，李婧，廖一帆【摘要】 目的观察苜蓿总皂苷提取物抗大鼠动脉粥样硬化和降血脂作用。方法该实验采用高脂饲料、血管壁钙超载、内皮损伤三者结合引发大鼠大血管动脉粥样硬化斑块模型。检测指标：用紫外分光光度计测定血清总胆固醇 TCH，甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL?C)的含量;并计算低密度脂蛋白(LDL?C)的含量和动脉粥样硬化指数(AI);检测主动脉的病理变化。结果苜蓿总皂苷提取物可明显降低高脂血症大鼠的血清 TCH，TG，LDL?C 水平，明显升高HDL?C 水平，明显降低 AI，与模型组比较有显著性差异(P 【关键词】 苜蓿总皂苷提取物; 大鼠; 动脉粥样硬化; 降血脂Abstract：ObjectiveTo observe the anti?atherosclerotic and hypolipidemic effects in rats of alfalfa extract of total saponins. MethodsThe atherosclerosis model in rats was set up by high fat diet in combination with blood vessel wall calcium overload and endothelial ?fat 2 / 10levels(TC，TG，LDL?C , HDL?C and AI)in serum were measured by ultraviolet rats were sacrificed and the aorta, heart, liver and renal were collected for pathological changes. ResultsAlfalfa extract of total saponins could significantly decrease the contents of serum TC，TG , AI and LDL?C，and reduce the score of pathological changes of aorta, heart, liver and renal，while the level of HDL?C was increased as compared with those of model group(P Key words： Total saponins of alfalfa extract; Atherosclerosis; Anti?atherosclerotic苜蓿为豆科植物紫苜蓿 Medicago sativa L.或南苜蓿 Medicago hispida Gaertn.的全草，是多年生草本植物。性味：苦，平，主要功能为“清脾胃、利大小肠，下膀胱结石” 。 本草纲目记载苜蓿“安中利入，可久食。利五脏、轻身健人。 ”民间常有“用饲牛草，嫩时人兼食之”之说。在我国中部、西部、华北广大地区，人们常摘苜蓿嫩草入菜。自古以来，苜蓿既可以作为食物入菜充饥，又可以作为药物以疗疾患。苜蓿总皂苷提取物不仅对于高脂血症有治疗作用，且由于毒性低微，还可以作为中老年人长期使用的保健品。苜蓿提取物在防治血脂代谢紊乱和抗 AS方面有其独到之处1。一般降胆固醇制剂的作用部位在肝3 / 10脏，是当胆固醇通过胃肠道吸收进入血液达到肝脏后才起作用。而苜蓿提取物降胆固醇的机理是在胃部阻止外源性胆固醇在胃肠道吸收，同时促进内源性胆固醇和胆汁的排泄，使血清磷脂浓度降低，血浆蛋白在体内分布正常，并能有效地控制血浆胆固醇和甘油三酯，从而避免了对肝脏损害的不良反应，使苜蓿提取物的开发具有更大的前景。国外对其展开研究，但是国内研究较少。本实验就苜蓿提取物作为药物在抗大鼠动脉粥样硬化和降血脂方面的作用进行研究。 1 材料与仪器受试药物苜蓿总皂苷提取物，由中山市中健药物研究所有限公司提供，批号：060828，061010。加蒸馏水配成所需浓度，4保存备用。药品和试剂绞股蓝总苷片，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供，批号：E6A003，规格：每片含绞股蓝总苷 20 mg，药片粉碎后加蒸馏水配成所需浓度，4保存备用;丙硫氧嘧啶片，由上海复星朝晖药业有限公司提供。批号：070901，规格：每片含丙硫氧嘧啶 50 mg;维生素 D3注射液，由上海通用药业股份有限公司提供，批号：080401，规格： mg/ml。总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL?C)测定试剂盒，高密度脂蛋白胆固醇4 / 10(HDL?C)测定试剂盒，批号分别为011M042、010M050、012L028、012L028，均由上海名典生物工程有限公司提供;胆固醇，由上海科瑞生物有限公司提供;戊巴比妥钠，由北京化学试剂公司提供，批号：XX1019;食用猪油，由宜昌双汇食品有限责任公司提供。仪器 Spctrumlab 53 power 紫外分光光度计，上海棱光技术有限公司产品;TB?718E 组织自动包埋机，湖北泰维医疗科技有限公司提供;TC?120S 组织自动脱水机，湖北泰维医疗科技有限公司提供;RM2135 石蜡切片机，德国Leica 公司产品;HM525 冰冻切片机，德国 Microm 公司产品;80?2B 型台式离心机，上海安亭科学仪器厂;电子精密天平，奥豪斯公司;恒温水浴锅，北京市医疗设备厂提供;WH?1 微型旋涡混合仪，上海泸西分析仪器厂。动物 Wistar 大鼠，SPF 级，体质量(20010)g，雄性，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK(鄂)XX?0005。2 方法1，2造模取雄性大鼠 50 只，每只大鼠右下肢肌肉注射维生素 D3 3105U/kg，并给予高脂饲料(2%胆固醇，%胆酸钠，3%猪油，%丙基硫氧嘧啶，%基础粉末饲料，维生素 D3粉剂106 U/kg)，7 d 后行球囊损伤手术。另取 10 只作为空白对照，给予普通饲料。5 / 10球囊损伤手术：动物用戊巴比妥钠(35 mg/kg 体重)腹腔麻醉，仰卧固定，皮肤消毒，正中切开颈部皮肤，分离左侧颈总动脉，结扎远心端，插入球囊，进入约 8 cm，球囊内注入 ml 生理盐水，向回拉动 34 cm，放水再进入约 8 cm，注水、回拉，共 3 次。拔出球囊，层缝合皮下组织、皮肤。消毒切口皮肤，切口处洒适量注射用青霉素粉剂。术后连续 7 d 给予肌肉注射青霉素，切口处用碘酒消毒。分组及给药术后按体质量随机分为 5 组。苜蓿总皂苷高剂量组：苜蓿总皂苷提取物 g/kg;苜蓿总皂苷中剂量组：苜蓿总皂苷提取物 g/kg;苜蓿总皂苷低剂量组：苜蓿总皂苷提取物 g/kg;阳性组：绞股蓝总苷片 56 mg/kg;模型组：等体积蒸馏水，灌胃同时给予高脂饲料;空白组：等体积蒸馏水，灌胃同时给予普通饲料。按体质量 ml/100 g 灌胃，1 次/d，连续给药 90 d。取样及检测指标末次给药后，禁食不禁水 12 h，断头取血，3 000 r/min 离心 15 min，分离血清。用紫外分光光度计测定血清总胆固醇(TCH) (PAP 法)，甘油三酯(TG)(PAP 法)和高密度脂蛋白(HDL?C)(PTG?Mg2+ ?PAP 法)的含量;并计算低密度脂蛋白(LDL?C)的含量和动脉粥样硬化指数(AI)。分离主动脉，纵行切开，%生理盐水冲洗干净，苏丹6 / 10染色，照相，以百分率法算出斑块面积占动脉壁总面积的百分率，按分级法统计主动脉病变级别。计量资料以组间 t 检验进行统计比较，等级资料以秩和检验进行统计比较，百分率以卡方检验。主动脉斑块分级标准：0 级?内膜表面光华，无奶油色变化，即无斑块;级?内膜有广泛的奶油色或乳白色变化，但无凸出于表面的斑块;1 级?有明显的奶油色凸起斑块，面积小于 3mm2;2 级?斑块面积大于3mm2;3 级?有许多大小不等的斑块，有的融合成片，大块的斑块面积超过 3mm2;4 级?动脉内膜表面几乎为全为融合的斑块所覆盖。 主动脉用 10%福尔马林溶液固定 36 h 后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，在切片机上横断面制成 5 m 厚连续切片。HE 染色片随机选取 10 个视野测定主动脉内膜厚度，内膜/中膜厚度比值。分离心脏，用 10%的福尔马林固定，再将心脏横切成3 块，每块冰冻切片至少两片，用苏丹及苏木素染色，每个切片一般都观察 10 个动脉断面并按下列标准分级：0 级?动脉内膜无脂质浸润;级?动脉内膜有轻度脂质浸润;1 级?内膜斑块占血管腔面积的 1/4;2 级?内膜斑块占血管腔面积的1/2;3 级?内膜斑块占血管腔面积的 1/2 以上;4 级?斑块几乎堵塞整个管腔。7 / 103 结果苜蓿总皂苷提取物对血脂的影响苜蓿总皂苷高、中剂量组使高脂血症大鼠的血清 TCH、TG、LDL?C 水平明显下降，而 HDL?C 水平明显上升，AI 明显下降，与模型组比较有显著性差异(P)。苜蓿总皂苷低剂量组对高脂血症大鼠的血清 TCH、TG、LDL?C 水平和 AI 呈下降趋势，HDL?C 水平呈上升趋势，但与模型组比较无显著性差异(P)，与绞股蓝总苷片组比较有显著性差异(P 主动脉病变情况肉眼观察正常对照组主动脉管腔光滑完整;模型组主动脉内膜可见针尖至绿豆大小的圆形或不规则黄色斑块或脂质条纹，病灶主要位于动脉分支开口及血管弯曲的凸面处，可见明显隆起内膜表面的灰白色斑块，局部血栓形成。苜蓿总皂苷提取物各组与模型组相对比，其病理改变显著较前者轻。主动脉斑块的病变分级苜蓿总皂苷提取物各组能够降低主动脉斑块的病变平均等级及粥样硬化面积/主动脉面积，与模型组比较有显著性差异(P 主动脉形态学观察各组动物胸主动脉经 HE 染色在显微镜观察发现，正常对照组管腔圆形，内膜、中膜和外膜分界清楚，管腔面由单层内皮细胞覆盖,细胞完整，中膜主要见梭形平滑肌细胞;外膜较薄，为疏松结缔组织。模型组管壁明显增厚，平滑肌增生明显,细胞排列紊乱，纤维组织增生伴片状或点状钙化，8 / 10弹性纤维层结构不清，形成纤维增生性动脉粥样硬化斑块。内皮损伤组管壁内皮细胞脱落，内膜增厚,斑块表面纤维帽薄，突出的斑块内含有坏死物质，平滑肌细胞减少，纤维组织增生伴片状或点状钙化，中膜明显萎缩,呈较典型的成熟动脉粥样硬化斑块。苜蓿总皂苷提取物各剂量组随着剂量的增加内膜变得较完整平坦,浸入内皮下的单核细胞明显少于模型组中膜平滑肌层排列较整齐。胸主动脉内膜和中膜厚度用图像分析仪检测，苜蓿总皂苷提取物各剂量组与模型组比较有显著性差异(分别 P 苜蓿总皂苷提取物对冠状动脉粥样硬化病变发生率及粥样硬化病变程度的影响苜蓿总皂苷提取物各剂量组可使冠状动脉病变分级及 AS 病变发生率降低，苜蓿总皂苷提取物各剂量组与模型组比较有显著性差异(P)。见表 4。表 4 苜蓿总皂苷提取物对冠状动脉粥样硬化病变发生率及粥样硬化病变程度的影4 讨论动脉粥样硬化是大、中动脉内膜出现含胆固醇、类脂肪等的黄色物质，多由脂肪代谢紊乱、神经血管功能失调引起3。随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，该病已成为我国发病死亡的主要原因之一。其病理变化主要累及体循环系统的大型弹力型动脉(如主动脉)和中型肌弹力型动脉(以冠状动脉和脑动脉罹患最多)，受累动脉的病变从内膜开始，先后有多种病变同时存在，包括局部有9 / 10脂质和复合糖类积聚，出血和血栓形成，纤维组织增生和钙质沉着，并有动脉中层的逐渐退化和钙化。现代细胞分子生物学技术显示，病变都具有平滑肌细胞增生，大量胶原纤维、弹力纤维和蛋白多糖等结缔组织基质形成，以及细胞内外脂质积聚的特点。所以控制高血脂对于治疗动脉粥样硬化是非常重要的途径3。 目前国内外在治疗 AS 疾病中运用最多的是他汀类4,临床发现长期服用这些化学降脂药物可发生多种不良反应如对肝、肾功能有一定损害作用,严重时甚至危及人体生命安全;具有用药渐降,停药渐升弊端。所以国外正在研究免疫治疗动脉粥样硬化，但仍在实验阶段4。天然中草药防治高脂血症及抗动脉粥样硬化的研究工作正日益受到国内外医学界的重视,大量药理研究及临床报道业已证明中草药具有一定的调脂作用和抗动脉粥样硬化作用,且毒副作用少5。中药苜蓿无毒性，一直以来，作为食物入菜充饥或饲料喂养牲畜，在防治血脂代谢紊乱和抗 AS 方面有其独到之处。国外对其展开了研究，但是国内研究较少。动脉粥样硬化按其临床表现 AS 属于中医“痰浊”“血淤”的范畴， “痰凝” “血淤”是其主要病理改变。脾虚失运是形成 AS 痰浊的主要内因。饮食不当是促成 AS 痰浊的重要外因。年老体衰，天癸将竭，肾气渐衰。 肾阳衰10 / 10则心阳不振，心气亏虚。肾阴不足则不能滋养五脏。脏腑功能减退，鼓动无力，气血津液失于温煦，不能运行， 则致气虚、气滞 、痰聚、血淤，诸因素损伤脉络，并与脉络相搏结，着而不去，