幽门螺杆菌抗体分型ppt课件.ppt

幽门螺杆菌及其分型的临床意义 1 幽门螺杆菌 H pylori 1982年澳大利亚学者Marshall和Warren从胃黏膜中分离出Hp常见于人的胃窦和幽门部位可通过一端多条鞭毛移动是一种革兰氏阴性螺旋菌分泌高活性的尿素酶和过氧化氢酶VacA CagA导致宿主的炎症反应 2 Marshall和Warren 1979年根据活组织切片检查结果 Warren发现50 左右的病人的胃腔下半部分附生着许多微小的 弯曲状的细菌 Warren的发现引来了同行的质疑 但也引起了Marshall的极大兴趣 他们决定联合对取自100个病人的活组织切片进行研究 经过反复试验 Marshall成功地培育出一种当时尚不为人知晓的细菌 后来被命名为幽门螺杆菌 基于试验结果 Marshall和Warren认为 幽门螺杆菌是导致胃炎 十二指肠溃疡或胃溃疡的关键因素 发现这种细菌 使胃炎 十二指肠溃疡或胃溃疡的诊断治疗变得及其简单 3 伟大的发现 1983年Marshall写论文投给某杂志 但遭到编辑部的拒绝 我们需要56篇文章 而你是第67篇 1984年7月 Marshall决定用自己的胃做实验 他把60毫升的幽门螺杆菌培养液喝了下去 14天后 马歇尔出现了明显的恶心 呕吐症状 10天后的胃镜检查发现他确实患了胃炎 4 2005年诺贝尔医学奖 2005年10月3日 瑞典卡罗林斯卡医学院宣布 把2005年诺贝尔生理学或医学奖授予澳大利亚科学家BarryJ Marshall和J RobinWarren 以表彰他们发现了导致胃炎和胃溃疡的细菌 幽门螺杆菌 诺贝尔奖委员会在授奖词中说 由于BarryJ Marshall和J RobinWarren的发现 使得原本慢性的 经常无药可救的胃溃疡变成了只需抗生素和一些其他药物短期就可治愈的疾病 5 幽门螺杆菌与消化道疾病 1994年世界卫生组织 WHO 把Hp归为一级致癌物 6 内窥镜诊断 7 传播途径 幽门螺杆菌能在人体内生长 繁殖 又能通过粪便及唾液排出体外 人是幽门螺杆菌的传染源 它通过口 口传播 粪一口传播 经内窥镜传播或密切接触等方式进行传播 8 内科学 p 380 幽门螺杆菌作为慢性浅表性胃炎最主要病因的确立基于如下证据 1 绝大多数慢性活动性胃炎患者胃粘膜中可检出幽门螺杆菌 2 幽门螺杆菌在胃内的分布与胃内炎症分布一致 3 根除幽门螺杆菌可使胃粘膜炎症消退 4 从志愿者和动物模型中可复制幽门螺杆菌感染引起的慢性胃炎 幽门螺杆菌通过上述产氨作用 分泌空泡毒素A VacA 等物质而引起细胞损害 其细胞毒素相关基因 CagA 蛋白能引起强烈的炎症反应 其菌体胞壁还可作为抗原诱导免疫反应 这些因素的长期存在导致胃粘膜的慢性炎症 9 Maastricht1 1995年观点 强烈地建议治疗消化道溃疡疾病消化道出血性溃疡低级别胃粘膜相关淋巴瘤有严重反常的胃炎胃癌切除术之后早期 10 亚太地区共识 1997年观点 推荐指征 消化道溃疡疾病溃疡出血或穿孔伴有溃疡和消化不良病史 NSAID治疗早期胃癌切除术低级别胃粘膜相关淋巴瘤胃癌家族史消化不良 检测到Hp 11 Maastricht2 2000年观点 强烈建议治疗DU GU 活动的或不活动 包括PUD 胃粘膜相关淋巴瘤萎缩性胃炎胃癌切除术后GC病人的直系亲属病人的要求 12 Maastricht3 2005年观点 对于检测准确性高的可以确认Hp感染的血清学检测方法 可以用于Hp现症感染的检测 13 中国庐山共识 2007年观点 幽门螺杆菌根治适应证 消化性溃疡胃粘膜相关淋巴组织 MALT 淋巴瘤慢性胃炎伴胃粘膜萎缩 糜烂慢性胃炎伴消化不良症状 个人要求治疗 14 亚洲HP的流行病学 15 中国的HP流行病学 参考 张万岱 胡伏莲等 中国自然人群幽门螺杆菌感染的流行病学调查 2006 16 HP检测的方法 17 HP检测方法的比较 能 不需要 数小时 取血 WBT 否 酶标仪 数小时 取血 ELISA 否 不需要 数分钟 取血 金标法 否 质谱仪或放射性物质检测仪 数小时 吹气 UBT 否 PCR检测设备 数小时 胃镜 PCR 否 不需要 数分钟 胃镜 尿素酶法 否 Hp培养设备 数天 胃镜 细菌培养 否 病理检查设备 数小时 胃镜 组织学法 能否分型 辅助设备 所需时间 取材方式 方法 18 小结 HP和消化道疾病密切相关 检测很重要中国健康人群HP感染率59 检测量很大目前主流的呼气试验和血清抗体检测 没有检测毒性 19 幽门螺杆菌的致病机制 HP基因多态性是造成HP感染后不同临床结局主要的原因 现在认为与空泡毒素A VacA 基因和细胞毒相关基因 CagA 及其基因表达的蛋白质与致病有关 VacA和CagA蛋白是HP毒素的主要标志 部分革兰阴性和阳性致病菌的染色体上毒力因子基因的特殊区域称为 致病岛 CagA致病岛是HP的主要毒力因子 CagA基因序列的拓展研究发现 CagA是Cag致病岛中基因之一 CagE是诱导胃上皮细胞产生白介素8 IL 的主要基因 IL是诱发胃黏膜炎症的主要细胞因子 20 HP毒力因子 空泡毒素 VacA 是HP分泌的一种蛋白毒素 可引起作用的靶细胞发生空泡化 细胞凋亡 细胞骨架重排 甚至细胞死亡等形态学改变 是HP重要的毒力因子 细胞毒素 CagA 虽不直接介导毒素活性 但与空泡毒素 VacA 的表达密切相关 常与空泡毒素 VacA 同时存在 故将其命名为HP细胞毒素相关蛋白简称CagA CagA可能与VacA的转录 折叠运转及功能有关 CagA可导致宿主出现严重的炎症反应 尿素酶 Urease 幽门螺杆菌能够在胃里生存只要依靠尿素酶 尿素酶可以分解产生的氨 使细胞能量代谢发生障碍 并出现病理性改变 21 HP分型的定义 型 产细胞毒素HP菌株 其检出率约占总HP感染的50 60 这类菌株感染能使胃上皮细胞出现空泡 变形和损害 引起溃疡和诱发癌变 型 不产生细胞毒素的HP 即 CagA 和VacA 这一类HP菌株毒性较小 感染后一般仅引起慢性浅表性胃炎而无临床症状 22 HP分型的临床意义 HP分型能为临床开展 选择性根治 提供了重要的实验诊断依据 对于感染了HP的上消化道疾病患者 应引起临床医师的足够重视 进行毒力分型检测 帮助制定根除HP 胃镜及病理检查随访的诊疗计划 利于胃癌的预防并合理节约医疗资源 型 产细胞毒素HP菌株 其检出率约占总HP感染的50 60 这类菌株感染能使胃上皮细胞出现空泡 变形和损害 引起溃疡和诱发癌变 型 不产生细胞毒素的HP 即 CagA 和VacA 这一类HP菌株毒性较小 感染后一般仅引起慢性浅表性胃炎而无临床症状 型的HP感染者中的胃癌和溃疡的患病率显著高于 型HP的感染者 说明 型HP感染可能更易导致较为严重的上消化道疾患 如溃疡或癌肿 因此 型HP感染患者有必要进行根除治疗 23 HP分型的治疗建议 有症状 型感染 型感染 无症状 需治疗 个人意愿 不需治疗 胃镜检查 24 上海政府网站截图 25 2007国家科技进步二等奖 上海长海医院消化内科李兆申教授等筛选出幽门螺杆菌 Hp 的重要致病因子 细胞毒素相关抗原 CagA 和空泡变性细胞毒素 VacA 研究者还提出Hp毒力存在差异的新理论 并应用Hp重组CagA建立检测CagA的血清学方法 研制相关的检测试剂盒 相关成果日前获得2007年度国家科学技术进步二等奖 李教授介绍 该项目针对Hp毒力因子众多 致病机制复杂 临床诊断有待规范等问题 开展了大规模流行病学调查 筛选出Hp两个重要致病因子 CagA和VacA 同时证明了CagA是导致消化性溃疡发生的关键因子 也是胃癌发生的重要危险因素 研究小组发现 Hp中国菌株的CagA VacA和致病岛阳性率高 毒力强 阐明了Hp的 中国特色 研究者还提出Hp分类学说 认为Hp菌株分为有毒株 CagA VacA阳性 和无毒株 CagA VacA阴性 该学说得到学术界广泛认同 被SCI他引407次 该项目研究人员采用Hp重组CagA建立了检测Hp的血清学方法 并研制出可同时检测血清CagA VacA和尿素酶抗体的免疫印迹诊断试剂盒 可判断Hp毒力 该技术可覆盖国内95 以上的临床检测需要和科研需求 同时 研究人员根据Hp毒力进行选择性根治 将已有的Hp根治方案进行优化 增强了治疗的针对性和有效性 节约了医疗资源 中国医学论坛报 26 深圳市伯劳特公司 国内刚刚拿到 唯一有产品注册证的幽门螺杆菌分型检测试剂盒生产商 27 研发过程 2000年7月获得中检所新生物制品审评检验报告2002年5月上海医疗器械质量监督检验中心的注册检验2002年7月瑞金医院的临床试验报告2002年7月长宁区中心医院的临床试验报告2002年8月上海市药监局颁发医疗器械注册证2003年12月国家药监局颁发医疗器械注册证2005年6月和2007月7月北京医疗器械质量监督检验中心的注册检验2007年12月获得国家科技进步二等奖 2010年1月完成上海长海医院 青海省人民医院和吉林大学中日友谊医院临床试验 2010年3月获得中国药品生物制品检定所注册检验报告2011年7月获得国家食品药品监督管理局产品注册证 28 获奖证书 29 免疫印迹法背景介绍 免疫印迹技术 它与内切酶的发现和PCR基因扩增技术一起 在上世纪做为分子生物学领域三大发现之一 给人类生物工程带来了革命性进展 基本原理 将提取的蛋白混合物先进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质按照分子量大小不同分离然后再转印至印迹膜 显色后按照显色带位置不同判断分子量多少和所含蛋白质数量 称为Southernblot 其制造主要有三个工序 将蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离 将分离的组分转印到印迹膜上 对转印到印迹膜的蛋白成分进行免疫学检测 30 免疫印迹检测原理 本产品是将CagA VacA的菌体抗原利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白按分子量大小不同依次分开 再转印至印迹膜上 采用酶联免疫反应技术 如果被检者血清有相应抗体则在抗原的相应位置出现显色区带 根据条带显色位置判断被检血清中各种HP抗体 由抗体出现的种类不同推断HP类型 再根据显色带的强弱 消长可观察治疗效果 预测溃疡有无复发的可能性 31 反应过程 32 实验材料 蒸馏水1000ul可调加样枪一支10ul加样枪一支吸嘴500ml带盖瓶摇床一台 33 操作步骤 在量杯中将浓缩洗涤液用蒸馏水按1 10的比例稀释成洗涤应用液 每槽加入洗涤液1ml 再加待测血清或全血10ul 放在摇床上摇动30分钟 取出反应槽 弃去槽中液体 并在平铺的纸巾上将其倒置经磕以拍干剩余液体 每槽加入洗涤液1ml 摇动洗涤1分钟 弃去槽中液体 并在平铺的纸巾上将其倒置经磕以拍干剩余液体 重复洗涤3次 每槽加入洗涤应用液500ul 再加酶联试剂10ul 放在摇床上摇动30分钟 同 3 洗涤3次 加显色剂0 5ml 5分钟后观察结果 待质控带和阳性带显色清晰 弃去槽内液体 用流水 自来水或蒸馏水 冲洗后取出印迹膜 等干后对比 标准带 判断结果 34 结果判断 35 判断标准 CagA抗体 VacA抗体 UreA抗体 UreB抗体 1 质控带未出现 表示本次试验无效 2 阴性结果 显色区带仅出现质控带 未见任何一条阳性区带 表示被检者血清中无HP抗体 3 型HP抗体阳性 仅UreA和UreB区带中任意一种或同时出现 未见CagA VacA区带 4 型HP抗体阳性 CagA VacA区带中任意一种或两种同时出现 36 产品适应症 各种胃 十二指肠疾病 包括胃 十二指肠溃疡 慢性胃炎 胃癌和胃淋巴瘤等 非溃疡性消化不良 缺铁性贫血口服铁剂治疗效果不佳者 儿童消化不良或不明原因的生长发育迟缓者 37 产品禁忌症 本产品检查无任何禁忌症 不需要空腹可随时进行采血检测 38 产品安全性 本产品属于体外诊断试剂类产品 不直接使用人体 对人体不造成创伤性损害 本产品为各种胃 十二指肠疾病的辅助诊断 任何疾病的诊断均需要结合临床病史资料综合判断 39 注意事项 1 室温大于20度小于37度2 试剂盒使用前要平衡室温3 加酶标的时候要换枪头4 严格操作流程 40 HP分型检测产品特点 国内唯一能检测HP分型的体外诊断试剂能直接观察HP血清学毒性反应全貌 包括了CagA VacA 尿素酶A和B可多人份同时检测 整个时间仅需1 5小时仅需10微升被检血清特异性强 97 0 敏感性高 98 0 41 部分学术论文 吴水河 刘家双 张阳德 等 幽门螺杆菌CagA VacA抗体与胃十二指肠疾病的相关性研究 中国内镜杂志 2003 9 3 11 13 余悠悠 沈霞 现代免疫学杂志 2004 24 6 511 513 张玫汤哲周英智 等 北京地区老年人群幽门螺杆菌感染的血清流行病学研究中华流行病学杂志 2005 26 9 687 689 张玫 汤哲 汤欣 等 社会因素对老年人群幽门螺杆菌感染的影响 世界