细胞生物学常用技术1

,细胞生物学常用实验技术,cellular levelSubcellular level Molecular level,显微技术 细胞分离技术 细胞培养技术 细胞组分的分级分离 细胞示踪技术 细胞分子生物学技术,一、显微镜技术 microscopy m 微米 = 10-6 m nm 纳米 = 10-9 m 埃 = 10-10 m (一) 光学显微镜技术 利用光线照明,将微小 物体形成放大影像的 仪器,1.显微镜的分辨率 显微镜或人眼在25cm的明视距离处,能分辨 被检物体微细结构最小间隔的能力。 d = 光学显微镜的分辨极限0.2m,100m,0.2m,2.光镜标本切片的制备 (1) 固定 定义：将组织浸入化学试剂中，通过在细 胞中大分子间形成交联，保持细胞 中原有结构的形态和位置的过程。 固定的目的： A 防止组织自溶或腐败 B 保持细胞原有的形态 C 保持细胞各种成分的原有位置 常用固定剂：乙醇、甲醛、戊二醛,(2)脱水 定义：借助某些化学溶剂置换组织内水分的过程。 常用的脱水剂：酒精 (3)包埋 定义：将组织块包入包埋剂使组织硬化的过程。 常用的包埋剂：液体石蜡、树脂 (4)切片 1-10 m,（5）染色 采用某些化学物质特异性或选择性地与细 胞内的某些成分相互作用，从而原位显示 细胞某种成分或结构的方法 A 选择性染色 考马斯亮蓝 蛋白质 Brachet反应,hematoxylin-eosin,B 特异性染色 酶 + 底物 抗原 + 抗体,+ substrate,antigen,antibody,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,酶标记：免疫组织化学技术荧光标记：免疫荧光技术,3.荧光显微镜技术 (1) 原理 荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波 长的短波光线，并发射出比原来吸收波长 更长的光,（2）荧光显微镜的基本构造 A 紫外光光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 滤光片,（3）常用的荧光染料 A 有机染料 荧光素 罗丹明 FITC,B 量子点 quantum dot-族、-族元素构成的半导体纳米结晶良好的光学稳定性抗光漂白性,（4）应用 A 免疫荧光显微技术 （Immunofluorescence microscopy） 抗体 + 荧光染料,B 绿色荧光蛋白 GFP,4.相差显微镜 （phase contrast microscope） (1)原理 波长 颜色 振幅 亮度 速度 相位,(2)应用 活体细胞观察,5.激光扫描共焦显微镜 （ Laser Scanning Confocal Microscope） (1)原理 在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置， 共轭聚焦装置和检测系统而形成的显微镜。,单色激光光源光源后照明针孔点光源 检测器前探测针孔分层扫描 三维重建,共扼,（2）应用 A 细胞的三维重建 B 细胞定量荧光检测 DNA RNA 蛋白质含量 C 细胞内Ca2+ pH动态检测 D 细胞间通讯,果蝇胚胎原肠胚,（二）电子显微镜技术 利用电子与固体样品作用时所发出的信息, 对样品进行微区观察和分析的技术 亚显微结构 超微结构 1.电子显微镜的特点 高分辨率 理论上 d = 0.002 nm 实际上 d = 0.1 nm 生物标本 d = 2 nm 高放大倍率 1,000,000,阴极,阳极,聚光镜（电磁透镜）,物镜中间镜投影镜,电镜照片,照相底片,真空、上下颠倒,2.透射电子显微镜（Transmission electron microscope, TEM） (1)基本构造,(2) 超薄切片的制备 A 固定 戊二醛:蛋白质 锇酸: C=C (膜结构),B 脱水 上升梯度 乙醇：30% 50% 70% 80% 90% 95% 100%C 包埋 单体树脂加温聚合 D 切片 500 700 ,E 重金属染色 U(醋酸双氧铀) Pb(柠檬酸铅),NADP酶反应,嗜锇反应,TPP酶反应,2.扫描电子显微镜 （Scanning electron microscopy, SEM）,(1)原理 二次电子(2)分辨率 3-10nm(3)样品的制备 A 固定 B 脱水 C 干燥 临界点干燥 D 染色 Au Pt,透射电镜利用穿透标本的电子进行成像 (散射)观察组织的二维切片扫描电镜利用标本表面发射的二次电子成像观察组织的表面三维结构,（三）扫描探针显微镜 （Scanning probe microscope, SPM）1.扫描隧道显微镜 使用原子尺度的探针在标本表面扫描，在探针针尖和样品之间施加一定电压，产生随标本表面形貌变化的隧道电流。 分辨率高 可在非真空状态下工作 直接观察大分子的三维结构,2.原子力显微镜 通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察表面的微观信息。 样品无需具有导电性 可在三态下工作 活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面观测,二、细胞分离技术 （ cell separation） 从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法 1.制备单一细胞悬液 组织 单一细胞,消化,EDTA 细胞间连接,胰酶 细胞外基质,二、细胞分离技术 （ cell separation） 从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法 1.制备单一细胞悬液 组织 单一细胞,消化,EDTA 细胞间连接,胰酶 细胞外基质,2.分离不同类型细胞 (1) 离心 （centrifugation） 大小 密度 形状 小 轻 不规则 大 重 圆形,(2) 免疫磁珠法,利用带有特定单抗的免疫磁珠与靶细胞的特异结合，快速地从多细胞悬液中将目的细胞分离出来。,(3) 流式细胞仪 ( flow cytometry) 能够快速分选或检测细胞及其组分的物理或 化学特性的技术 A 原理: 抗原+抗体* 荧光标记 B 样品制备 细胞悬液制备 细胞固定 细胞染色,B 应用 * 细胞分选 cell in 1000 5000 cells/sec * 细胞大小测量 * DNA 含量测定 * 免疫表型分析 * 细胞功能分析 * 细胞凋亡研究,细胞周期分析,药物处理前后HT29细胞的流式细胞分析结果,G0/G1 60.86%S 29.14%G2 10.00%,G0/G1 37.68%S 37.56%G2 24.76%,A,B,ND-1-QD605标记不同大肠癌细胞的流式细胞定量分析,(4) 激光捕获显微切割技术 （Laser capture microdissection，LCM） 从组织切片中精确分离获取单一细胞的方法,工作原理及过程:A 制备组织切片B 镜下将组织切片覆以薄膜C 激光束切割特定细胞或区域D 收集管收集,三、细胞培养技术 （Cell culture） 从活体组织中分离出特定的细胞，在一定的 条件下进行培养，使之能够继续生存、生长以 至增殖的方法 in vitro 用培养细胞做实验 in vivo 用动物做实验,1.细胞培养的条件 (1) 固体表面：培养瓶、培养皿 (2)培养基 常见培养基：1640 DMEM,(3)无菌 无菌操作：超净工作台、火焰消毒等 培养液中加入抗菌素 器械、溶液消毒（烤箱、高压灭菌、过滤） (4)其他 温度 37 湿度 100% CO2浓度 5%,2.细胞培养的传代 原代培养:直接取材于有机体的细胞培养 取材 切割 消化 培养 传代培养:将原代培养存活的细胞从培养瓶中 取出，以1:2以上的比例扩大培养 原代培养 传代培养(保持分化特性),传代,3.细胞系（Cell line） 在细胞培养中，偶然情况下产生的具有无限繁 殖能力，能够无限传代的细胞群。 变异细胞 细胞系 HeLa 人宫颈癌上皮细胞 3T3 小鼠成纤维细胞,无限繁殖,相差显微镜观察培养中的HeLa细胞,4.细胞融合（Cell fusion） （1）定义 在自然或人工条件下，使二个或二个以上 细胞合并形成一个细胞的过程。,异核体,杂交细胞,分裂,（2）促融方法 生物学方法：仙台病毒 化学方法：PEG 物理方法：电脉冲打孔仪（3）应用 A 细胞核和细胞质 间的相互作用 B 膜蛋白的流动性,C 基因定位D 单克隆抗体制备 B 淋巴细胞 肿瘤细胞,Mouse cell,Human cell,division,E 细胞周期相关因子的发现,四、细胞组分的分级分离 通过逐级分离对细胞内细胞器和各种成分的 化学性质和功能进行研究的方法。 匀浆 分级分离 分析,匀浆液,膜细胞器大分子,低渗超声去污剂强制过滤研磨,细胞,破坏,（一）离心法 用于分离细胞器和大分子,配平 低温,1.差速离心法 分离对象:不同大小和形状的组分 （细胞核、细胞器） 具体方法:由低速到高速逐级沉降 (repeat),2.速度沉降法 分离对象:不同大小、形状的组分(沉降系数S) 比差速离心方法更精细 具体方法: 在离心管中予装5%-20%蔗糖梯度的离心介质,3.平衡沉降法 分离对象:密度不同的组分（与大小、形状无关） 具体方法：在离心管中予装一定密度梯度的离 心介质（20%-70%蔗糖、CsCl） 通常采用超速离心,（二）层析法（柱层析） 主要用于分离、纯化蛋白质,填充柱填料（固定相）流动相,1.离子交换层析 层析介质:阴离子或阳离子树脂 分离原理:电荷,2.凝胶过滤层析 层析介质:凝胶 分离原理:分子大小,3.亲和层析 层析介质: 基质 + 抗体 底物 分离原理: 亲和性,4.高压液相层析 HPLC 基质粒度小（3-10m）、分辨率高、 分离速度快,(三)电泳法 主要用于分离蛋白质、核酸 1.琼脂糖凝胶电泳 分离对象:核酸 支持介质:琼脂糖 凝固点 40-45 不同浓度凝胶具有不同孔径 电泳缓冲液:TAETBE 染料:溴化乙锭 EB,(三)电泳法 主要用于分离蛋白质、核酸 1.琼脂糖凝胶电泳 分离对象:核酸 支持介质:琼脂糖 凝固点 40-45 不同浓度凝胶具有不同孔径 电泳缓冲液:TAETBE 染料:溴化乙锭 EB,2.SDS-PAGE 分离对象:蛋白质(蛋白质分子量、亚单位组成) 样品处理: SDS 阴离子表面活性剂 - 巯基乙醇 还原剂 大小 电荷 形状 支持介质: 丙稀酰胺 甲叉双丙稀酰胺 染色: 考马斯亮蓝 银染 特异性蛋白 (western blottin