新城疫油苗和冻干苗疫苗的生产工艺流程

新城疫冻干疫苗生产工艺流程新城疫冻干疫苗生产工艺流程 1 生产用毒种制备 1 1 毒种繁殖 将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释 如 10 4或 10 5 尿囊腔内接种 10 日龄 SPF 鸡胚 每胚 0 1ml 选接种后 72 120 小时死亡 且病痕明显的鸡胚 分别收获鸡胚液 尿 囊液及羊水 装于灭菌容器内 将检验无菌 且对 1 鸡红细胞凝集价 1 640 微量法 1 512 的鸡胚液混合 定量分装于安瓿中 冷冻保存 注明收获日期 毒种代数等 1 2 毒种鉴定 1 2 1 病毒含量 按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为 10 倍系列稀释 取 10 7 10 8 10 9 3 个稀释度各尿囊腔内接种 10 日 SPF 鸡胚 5 个 每胚 0 1ml 置 36 37 继续孵育 48 小 时以前死亡的鸡胚弃去不计 在 48 120 小时死亡的鸡胚随时取出 收获鸡胚液 同一稀释 度 的胚液等量混合 按稀释度分别测定红细胞凝集价 至 120 小时 取出所有活胚 逐个收获 鸡胚液 分别测定红细胞凝集价 凝集价 1 160 微量法 1 128 者判为感染 计算 EID50 每 0 1ml 病毒含量应 108EID50 1 2 2 纯净 应无细菌 霉菌 支原体和外源病毒污染 分别按 无菌检验或纯粹检验标无菌检验或纯粹检验标 准操作规程准操作规程 支原体检验标准操作规程支原体检验标准操作规程 外源病毒检验标准操作规程外源病毒检验标准操作规程 进行 进行 1 3 毒种保存 在 15 以下保存 应不超过 1 年 1 4 毒种继代 应不超过 3 代 2 制苗材料选择 选择发育良好的 9 11 日龄 SPF 鸡胚作为制苗材料 3 制苗用毒液的制备 3 1 接种 取生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释 如 10 4或 10 5 每胚尿囊腔内接种 0 1ml 接种后密封针孔 置 36 37 继续孵育 不必翻蛋 3 2 孵育和观察 鸡胚接种后 每日照蛋一次 将在 60 小时前死亡的鸡胚弃去 60 小时后 每 4 8 小时照蛋一次 死亡的鸡胚随时取出 直至 96 或 120 小时 不论死亡与否 全部取出 气 室向上直立 置于 2 8 冷却 3 3 收获 将冷却 4 24 小时的鸡胚取出 用碘酊消毒气室部位 然后以无菌手术剥除气室部 卵壳 剪开尿囊膜 吸鸡胚液 每若干个鸡胚的胚液混合为一组 收获后的胚液置于灭菌瓶 中 作好标识 留样后 结冻保存 在收获胚液的同时 应逐个检查鸡胚 如胎儿腐败 胚液混浊及有任何污染可疑者弃去 不用 4 半成品检验 4 1 无菌检验 经处理过的胚液 每组分别取样 按 无菌检验或纯粹检验标准操作规程无菌检验或纯粹检验标准操作规程 进行无菌检验 应无细菌生长 4 2 病毒含量测定 按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为 10 倍系列稀释 取 10 7 10 8 10 9 3 个稀释度各尿 囊腔内接种 10 日 SPF 鸡胚 5 个 每胚 0 1ml 置 36 37 继续孵育 48 小时以前死亡的鸡 胚弃去不计 在 48 120 小时死亡的鸡胚随时取出 收获鸡胚液 同一稀释度的胚液等量混 合 按稀释度分别测定红细胞凝集价 至 120 小时 取出所有活胚 逐个收获鸡胚液 分别 测定红细胞凝集价 凝集价 1 160 微量法 1 128 者判为感染 计算 EID50 每 0 1 ml 病毒 含量 107EID50者可用于配制疫苗 5 配苗及分装 将检验合格的若干组鸡胚液滤过 混合于同一容器内 按规定羽份 加一定比例的蔗糖脱 脂奶粉作稳定剂 使其最终蔗糖含量为 2 5 脱脂奶粉含量为 5 同时加入适宜的抗生素 充分摇匀 定量分装 每羽份病毒含量应 106EID50 分装后迅速进行冷冻真空干燥 6 成品检验 6 1 物理性状 6 1 1 外观检查 疫苗瓶上的标签 打印出的羽份或头份 生产批号 有效日期清晰可见 位置适当 瓶上的铝盖稳固不松动 6 1 2 眼观检查 将疫苗拿到与眼平行位置观察呈微黄色 海绵状疏松团块 然后再轻微 振动 疫苗松动并与瓶壁分离 判为合格 6 1 3 溶解性检查 用稀释液注射到疫苗瓶内 经轻微振动 疫苗应迅速完全溶解 无粘 块或粘团出现 判为溶解性良好 6 2 无菌检验 按 无菌检验或纯粹检验标准操作规程无菌检验或纯粹检验标准操作规程 进行 如有菌生长 应进行杂菌 计数 并作病原性鉴定 按 杂菌计数和病原性鉴定操作细则杂菌计数和病原性鉴定操作细则 进行 和禽沙门氏菌检验 每羽份非病原菌数应不超过 1 个 按 禽沙门氏菌检验法禽沙门氏菌检验法 进行 6 3 支原体检验 按 支原体检验法支原体检验法 进行 应无支原体生长 6 4 鉴别检验 6 4 1 选择发育良好的 10 日龄 SPF 鸡胚 10 只 划出尿囊腔接种部位 6 4 2 将疫苗用无菌生理盐水稀释至 105 0EID50 0 1mL 与等量抗鸡新城疫病毒特异性血清 混合 室温中和 1 小时后 尿囊腔接种 每胚 0 1mL 6 4 3 将接种后鸡胚用石蜡封孔后 置 37 继续孵育 观察 120 小时 在 24 120 小时内 应不引起特异死亡 且至少存活 8 只 鸡胚液作红细胞凝集试验 应为阴性 6 5 外源病毒检验 按 外源病毒检验法外源病毒检验法 进行 6 6 安全检验 下列方法任择其一 6 6 1 用鸡胚检验 将疫苗用无菌生理盐水稀释 尿囊腔内接种 10 日龄鸡胚 10 只 每胚 0 1ml 含 10 个使用剂量 接种后 24 72 小时 鸡胚死亡率应不超过 20 为合格 如死亡 率超过 20 可用 20 个鸡胚重检 1 次 重检结果死亡率仍超过 20 该批疫苗判为不合 格 6 6 2 用鸡检验 用 2 7 日龄 SPF 雏鸡 20 只 合成两组 第 1 组 10 只 每只滴鼻接种 0 05mL 10 个使用剂量 第 2 组 10 只 不接种作为对照 两组在相同条件下分别饲养管 理 观察 10 日 应无不良反应 如有非特异性死亡 免疫组与对照组均不超过 1 只 6 7 效力检验 下列方法任择其一 6 7 1 用鸡胚检验 6 7 1 1 鸡胚选择 选择发育良好的 10 日龄 SPF 鸡胚 15 个 划出尿囊腔接种部位 作出 批组及滴度标记 每一滴度接种 5 个 6 7 1 2 疫苗稀释 将疫苗按瓶签注明羽份 用灭菌生理盐水稀释至 1 羽份 0 1mL 再作 10 倍系列稀释至 10 7 6 7 1 3 接种 分别取 10 7 10 6 10 5三个稀释度尿囊腔内接种鸡胚各 5 个 每胚 0 1mL 用石蜡封孔 6 7 1 4 孵育 置 37 继续孵育至 120 小时 每天上 下午各照检 1 次 48 小时以前死亡 的鸡胚弃去不计 在 48 120 小时死亡的鸡胚 随时取出放在 2 8 冰箱中 至 120 小时取 出全部活胚放在 2 8 冰箱中 24 小时 6 7 1 5 凝集价 HA 测定与计算鸡胚半数感染量 EID50 将冷却鸡胚取出 将同一稀 释度的死亡鸡胚液等量混合 分别测定红细胞凝集价 将活胚逐个收获鸡胚液 分别测定 红 细胞凝集价 HA 160 微量法 128 者判为感染 计算半数感染量 每羽份 106 5EID50 国家标准每羽份 国家标准每羽份 106 0EID50 判为合格 6 7 2 用鸡检验 6 7 2 1 鸡的选择 选取 30 60 日龄健康易感鸡 血凝集抑制价应 4 10 只 6 7 2 2 疫苗稀释 将疫苗按瓶签注明羽份 用灭菌生理盐水稀释成每 0 05mL 含 1 100 使 用剂量 6 7 2 3 免疫及攻毒 每只鸡滴鼻接种 0 05mL 10 14 日后 连同条件相同的对照鸡 3 只 各肌肉注射鸡新城疫北京株强毒 104 0ELD50 观察 10 14 日 对照鸡全部发病死亡 免疫鸡 至少保护 9 只为合格 6 8 剩余水分测定 按 剩余水分测定方法剩余水分测定方法 进行 应符合规定 6 9 真空度测定 按 真空度测定方法真空度测定方法 进行 应符合规定 鸡新城疫低毒力活疫苗生产工艺流程图 主要过程控制点和控制项目鸡新城疫低毒力活疫苗生产工艺流程图 主要过程控制点和控制项目 注 为关键控制点 为控制项目 抽 样 检 验 装箱入库 贴 签 15 冷冻保存收 获 SPF 种胚 种蛋选择 种蛋消毒 前孵化 分 装 冻 干 粗 洗 纯化水洗 胶 塞保护剂 配制配 制 脉动蒸汽灭菌 出 箱 干 燥 接种途径 接种剂量 无菌检验 病毒含量 分装前 中 后无检 配 苗无菌检验 加 塞 压 盖 物理性状 安全检验 无菌检验 外源病毒检验 效力检验 后孵化及照蛋 接 种 冷 蛋 铝盖 分装瓶 纯化水粗洗 注射水洗 照蛋时间 培养温湿度 冷蛋时间 冷蛋温度 隧道烘箱灭菌 清洗 灭菌 新城疫灭活疫苗生产工艺流程新城疫灭活疫苗生产工艺流程 1 生产用毒种制备 1 1 毒种繁殖 将毒种用灭活生理盐水作适当稀释 如 10 4或 10 5 尿囊腔内接种 10 日 龄 SPF 鸡胚 每胚 0 1ml 选接种后 72 120 小时之间死亡且病痕明显的鸡胚 分别收获 鸡胚液 尿囊液及羊水 装于灭菌容器内 将检验无菌 且对 1 鸡红细胞凝集价在 1 640 微量法 1 512 以上的鸡胚液混合 定量分装于安瓿瓶中 冷冻保存 注明收获 日期 毒种代次等 1 2 毒种鉴定 1 2 1 病毒含量 按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为 10 倍系列稀释 取 10 7 10 8 10 9 3 个稀释度各尿囊腔内接种 10 日 SPF 鸡胚 5 个 每胚 0 1ml 置 36 37 继续孵育 48 小 时以前死亡的鸡胚弃去不计 在 48 120 小时死亡的鸡胚随时取出 收获鸡胚液 同一稀释 度 的胚液等量混合 按稀释度分别测定红细胞凝集价 至 120 小时 取出所有活胚 逐个收获 鸡胚液 分别测定红细胞凝集价 凝集价 1 160 微量法 1 128 者判为感染 计算 EID50 每 0 1ml 病毒含量应 108EID50 1 3 毒种保存 在 15 以下保存 应不超过 6 个月 1 4 毒种继代 应不超过 3 代 2 制苗材料选择 选择发育良好 9 10 日龄的易感鸡胚作为制苗材料 3 制苗用毒液的制备 3 1 接种 取生产用毒种 用灭菌生理盐水作适当稀释 如 10 4或 10 5 每胚尿囊内接种 0 1ml 接种后密封针孔 置 36 37 继续孵育 不必翻蛋 3 2 孵育和观察 鸡胚接种后 每日照蛋 1 次 将 60 小时前死亡的鸡胚弃去 此后 每 4 6 小时照蛋 1 次 死亡的鸡胚随时取出 直至 96 小时 不论死亡与否 全部取出 气 室向上直立 置于 2 8 冷却 4 24 小时 3 3 收获 3 3 1 鸡胚液的收获 将冷却的鸡胚取出 用碘酊消毒气室部位 然后以无菌手术破除气室 部卵壳 揭去卵壳膜 剪破绒毛尿囊膜及羊膜 谨防卵黄破裂 吸取胚液 对每个鸡胚在 吸取胚液前均应注意检查 凡胎儿腐败 胚液混浊及有任何污染可疑者 弃去不用 死胚和活胚分别收获 每若干个鸡胚分为一组 吸取胚液放于同一灭菌的容器内 每 组抽样测定血凝价 血凝价低于 1 160 微量法 1 128 者应弃去 同时作无菌检查 应 无细菌生长 收获的胚液灭活前在 2 8 左右保存 应不超过 5 日 3 3 2 鸡胚胎儿收获及浸出液的制备 在收获及胚液的同时 取病变胎儿 去头 脚 用 生理盐水洗 2 3 次 磨碎 制成 1 5 1 10 乳剂 加适宜的抗生素适量 然后 离心或以 4 层纱布一层铜纱网滤过 置自然沉淀 1 2 日 然后取样作无菌检查 以上清夜 作为配制双相油乳剂疫苗用 4 灭活 将上述无菌胚液以 4 层纱布及一层细铜纱网滤过 混合于一个大玻璃瓶内 吸出 数毫升样品备测毒价 其余胚液和鸡胚浸出液分别计量加入 10 甲醛溶液 随加随摇 使 其能充分混合 甲醛溶液的最终浓度为 0 1 加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中 以避免瓶 口附近黏附的病毒未能接触灭活剂 然后在 37 灭活 16 小时 以瓶内温度达到 37 开始 计时 期间振摇 3 4 次 在 2 8 保存 应不超过 1 个月 5 半成品检验 5 1 无菌检验 取灭活的胚液及鸡胚浸出液分别按附录 448 进行 应无菌生长 5 2 灭活检验 取 10 日龄无新城疫病毒抗体的鸡胚 6 个 每个接种灭活胚液 0 23ml 每 日照蛋 2 次 观察 5 日 鸡胚非特异死亡不应超过 1 个 对所有胚液分别测定血凝价 应 不出现血凝 认为灭活完全 如有可疑 应将可疑胚液进行重检 重检不合格者报废 鸡 胚浸出液也按照上述方法检查 5 3 毒价测定 将灭活前取出的胚液进行 10 倍系列稀释 取 10 7 10 8 10 93 个稀释度分 别接种 9 10 日龄无鸡新城疫病毒抗体的鸡胚 5 个 每胚尿囊内 0 1ml 每日照蛋 2 次 观察 5 日 无论死胚 活胚均应测定血凝价 血凝价 1 80 微量法 1 64 以上者 判 为感染 计算 EID50 每 0 1ml 病毒含量 108 EID50 方可用于制苗 6 单相油乳剂灭活疫苗制备 6 1 油相制备 取注射用白油 94 份 加司本 80 6 份 混合后 加硬脂酸铝 2 份 随加随 搅拌至透明为止 高压灭菌备用 6 2 水相制备 取吐温 80 4 份装入带玻璃珠的瓶中灭菌 冷却后加灭活胚液 96 份 充 分振瑶使吐温 80 完全溶解为止 6 3 乳化 取油相 3 份放于乳化罐内 开动电机慢速转动搅拌 同时徐徐加入水相 1 份 加完后再以 10000r min 搅拌 2 5 分钟 在终止搅拌前加入 1 硫柳汞溶液 使其最终浓度 为 0 01 乳化后 取 3 5ml 以 3000r min 离心 15 分钟 若有分层现 应重复搅拌 1 次 7 双相油乳剂疫苗制备 7 1 用乳化罐乳化 7 1 1 水相 油相制备同单相苗 但水相制备中 鸡胚液是按 4 加入吐温 而鸡胚浸出 液则按 6 加吐温 7 1 2 取油相 2 份放入乳化罐内 开动电机慢速转动搅拌 同时徐徐加入胚液 1 份 加完 后再以 10000r min 搅拌 7 1 3 取鸡胚浸出液 单相苗鸡胚液等量 放于乳化罐 开动电机缓缓加入上述油包水单 相苗 加完后再以 10000r min 搅拌 2 5 分钟 在终止搅拌前加入 1 硫柳汞溶液 使最终 浓度为 0 01 乳化后取 3 5ml 以 3000r min 离心 10 分钟 若分层严重应再搅拌 1 次 7 2 用乳化罐乳化 8 分装 定量分装 加盖密封 9 成品检验 9 1 物理性状 9 1 1 外观 为乳白色乳剂 9 1 2 剂型 单相苗为油包水型 取一清洁吸管 吸取少量疫苗滴于冷水中 应呈油滴状 不扩散 双相苗为水包油包水型 滴于冷水中 应呈云雾状扩散 9 1 3 稳定性 在 37 左右条件下放置 21 日 应不破乳 9 1 4 粘度 用 1ml 吸管 出口内径 1 2mm 吸取 25 左右的疫苗 1ml 令其垂直自然 流出 记录流出 0 4ml 所需时间 单相苗在 8 秒以内 双相苗在 5 秒以内为合格 9 2 无菌检验 按 无菌检验或纯粹检验标准操作规程无菌检验或纯粹检验标准操作规程 进行 应无菌生长 9 3 安全检验 用 30 60 日龄健康易感鸡 HI 抗体 1 4 6 只 各肌肉或颈部皮下注射 疫苗 1ml 观察 14 日 应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应 9 4 效力检验 用 30 60 日龄健康易感鸡 HI 抗体 1 4 15 只 其中 10 只各皮下或肌 肉注射疫苗 20 l 用 0 5ml 以下的注射器注射 另 5 只不免疫作对照 21 28 日后 连 同条件相同的对照鸡 5 只 各肌肉注射 105ELD50强毒 观察 14 日 对照组全部死亡 免 疫组至少保护 7 只为合格 9 5 甲醛含量测定 按 甲醛含量甲醛含量测测定法定法 进行 应符合 制品检验的有关规定 鸡新城疫灭活疫苗生产工艺流程图 主要过程控制点和控制项目鸡新城疫灭活疫苗生产工艺流程图 主要过程控制点和控制项目 注 为关键控制点 为控制项目 抽 样 检 验 装箱入库 贴 签 分 装 清 洗 胶 塞 脉动蒸汽灭菌 分装前 中 后无检 乳化 加 塞 压 盖 安全检验 无菌检验 效力检验 铝盖 分装瓶 灭菌 清洗 灭菌 物理性状 清洗 油相制备 水相制备 甲醛含量测定 硫柳汞含量测定 15 冷冻保存收 获 非免疫种蛋 种蛋选择 种蛋消毒 前孵化 接种途径 接种剂量 无菌检验 毒价测定 后孵化及照蛋 接 种 冷 蛋 照蛋时间 培养温湿度 冷蛋时间 冷蛋温度 无相应抗体 灭活 灭活检验 附录附录 1 剩余水份测定法剩余水份测定法 1 技术依据及原理 卡氏法是利用卡氏试剂中的碘和二氧化硫在砒啶和甲醇溶液中能与水起定量反应的原 理 从而测定水份 2 材料 仪器 试剂的准备及基本要求 2 1 仪器及设备 电子分析天平 精度 0 1mg 称量范围 0 110g 费休水份滴定仪 梅特勒 DL31 2 2 试剂 卡氏试剂 无水甲醇 纯水 2 3 检验器具 止血钳 开启苗瓶 玻璃棒 或能捣碎检品的器具 10ul 注射器 烧杯 2 4 样品 每批疫苗 4 个样品 2 5 其它 检验记录纸 笔 纱布和汗布手套 3 检验步骤 3 1 接通电源 打开费休水份滴定仪 梅特勒 DL31 主机 打印机 天平开关 3 2 按滴定仪的 RUN 键滴定仪自动滴定至终点 3 3 滴定仪屏幕显示待机模式 Drift 值在 25 以下指示箭头稳定 平指 时 开始滴定标定 滴度 3 3 1 按 F2 键至显示屏出现 H2O ISO 3696 3 3 2 连续按 F3 键至显示屏出现 please add sample 0 0100 g 3 3 3 天平去皮 通过进样孔注入已称重的纯水 用 10 l 注射器抽取 10 l 纯水置天平称 重 注射器放回天平后按 F3 3 3 4 按 F1 自动输入样品量 3 3 5 按 F2 显示样品重量 3 3 6 按 F3 确认样品重量 3 3 7 滴定至终点自动打印出结果 打印结束按 F3 返回到待机模式 3 3 8 重复标定只需依上述第 1 条开始同法操作 3 4 水份测定 3 4 1 将样品置天平称重 3 4 2 连续按 F3 键 显示屏出现 please add sample 0 0000g 5 000g 3 4 3 天平去皮后通过进样口将已称重的样品加入滴定杯中 将载样杯放回天平 3 4 4 按 F3 预滴定 3 4 5 按 F1 自动输入样品量 3 4 6 按 F2 显示样品重量 3 4 7 按 F3 确认样品重量 3 4 8 滴定至终点自动打印出结果 打印结束 按 F3 返回到待机模式 3 4 9 测定下一个样品只需依上述 4 4 1 开始 同法操作 4 记录与计算 5 结果判定 每瓶样品含水量不得超过 4 0 如有超过时 可重检一次 2 真空度测定法真空度测定法 1 技术依据及原理 依据 兽用生物制品质量标准 附录中的真空度测定法 即使用高频火花真空测定器 测定 它的基本原理是利用本仪器振动形成火花束 激励谐振荡回路 使次线线圈感应出 高频高压脉冲电压 使被检物产生不同颜色的辉光 根据颜色的变化来判断疫苗的真空度 2 注意事项 2 1 按照规定要求 在检验过程中至少要有一名检验员和一名复核员共同进行 确保检验 结果的准确性 2 2 检验要在光线较暗的操作室里进行 便于结果判定的准确性 2 3 被检样品从冷库中取出应擦干瓶壁上的水份 样品达到室温后再进行测定 3 材料 仪器 试剂的准备及基本要求 3 1 仪器及设备 电火花真空检测器 3 2 样品 所有被检样品 3 3 检验记录纸 笔 4 检验步骤 4 1 取待检样品 一字排列于暗室的操作台上 使瓶与瓶之间有一定距离 4 2 将真空检测器尾部电源插头插入 220V 电源插座里 4 3 将放电簧头对准被检样品 簧头不要触到瓶壁 打开开关 间歇适用 时开时关 4 4 观察并记录逐瓶样品的真空状态 5 安全措施 5 1 使用真空检测器时 人体不要接近仪器的头部电簧 以免高频电流的电击 但没有 生命危险 5 2 测定样品真空时 检测器必须缓慢移动 放电簧不应在一点停留时间过长 以免把玻 璃击穿 影响样品本身的效果 5 3 测定样品真空时 注意远离疫苗瓶上的金属帽 否则会造成错误信号 甚至在金属处 将玻璃击穿而造成漏洞 6 结果判定 如果容器内出现白色 粉色或紫色辉光 则真空度检查合格 3 无菌检验和纯粹检验无菌检验和纯粹检验 1 技术依据及原理 生物制品 除另有规定者外 都不应有外源微生物污染 灭活疫苗不得含有活的本菌 或本毒 各类生物制品必须按规定作无菌检验或纯粹检验 全部操作应在无菌条件下进行 2 注意事项 2 1 抽样后逐瓶检查包装 胶塞 瓶签有无破损和毁坏 瓶内有无杂质 2 2 为防止交叉污染 一个样品用一个吸管或一个注射器 2 3 各类生物制品的检验操作应在无菌条件下进行 2 4 检验过程要仔细 认真 2 5 保持实验室的清洁卫生 严格遵守常规的消毒制度 3 材料 仪器 试剂的准备及基本要求 3 1 仪器 24 26 36 38 温箱 检验器具 试管架 10ml 5ml 1ml 吸管 记号笔 记录纸 3 2 检验用培养基 3 2 1 无菌检验 厌氧性及需氧性细菌的检验 用含硫乙醇酸盐培养基 简称 T G 和酪胨琼脂培养基 简称 G A 霉菌及腐生菌检验 用葡萄糖蛋白胨汤 简称 G P 3 2 2 纯粹检验 用适宜本菌生长的培养基 4 检验步骤 4 1 抽样 应随机取样并注意代表性 4 1 1 制造疫苗用的各种原菌液 毒液和其它配苗组织乳剂 稳定剂及半成品的无菌或纯 粹检验 应每瓶 罐 分别抽样进行 抽样量为 2 10ml 4 1 2 成品的无菌或纯粹检验应按每批或每个亚批进行 每批按瓶数百分之一抽样 但不 应少于 5 瓶 最多不超过 10 瓶 分别进行检验 4 2 检验用培养基 4 2 1 无菌检验 4 2 1 l 厌氧性及需氧性细菌的检验 用硫乙醇酸盐培养基 T G 及酪胨琼脂 G A 4 2 1 2 霉菌及腐生菌检验 用葡萄糖蛋白胨汤 G P 4 2 2 活菌纯粹检验 用适于本菌生长的培养基 4 2 3 灭活检验 用适于本菌生长的培养基 或对本毒敏感的细胞 组织和动物 4 2 4 杂菌计数 用马丁琼脂或 G A 培养基 4 2 5 病原性鉴定 用 T G 培养基或其他适宜培养基 4 3 检验方法及结果判定 4 3 l 细菌原菌液及活菌苗半成品的纯粹检验 取样接种 T G 小管及适宜于本菌生长的其 他培养基斜面各 2 支 每支 0 2ml 1 支置 37 培养 1 支置 25 培养 观察 3 5 日 应 纯粹 4 3 2 病毒原毒液和其它配苗组织乳剂 稳定剂及半成品的无菌检验 取样接种 T G 小管 及 G A 斜面各 2 支 每支 0 2m1 1 支置 37 培养 1 支置 25 培养 观察 3 5 日 应无 菌生长 4 3 3 灭活检验 细菌灭活后 用适于本菌生长的培养基 2 支 各接种 0 2ml 置 37 培 养 5 日 应无菌生长 病毒液灭活后和细菌毒素脱毒后接种对本毒敏感的细胞 禽胚或实 验动物 应正常 4 3 4 含甲醛 苯酚 汞类等防腐剂和抗生素的制品 用 T G 培养基 50ml 接种样品 冻干制品先做 10 倍稀释 1ml 置 37 培养 3 日后自小瓶中吸取培养物 分别接种 T G 小管和 G A 斜面各 2 支 每支 0 2m1 1 支置 37 1 支置 25 另取 0 2ml 接种 1 支 G P 小管置 25 均培养 5 日 应无菌生长 如制品允许含一定数量非病原菌 应进一步作杂菌计数和病原性鉴定 4 3 5 细菌性活疫苗 冻干制品恢复原量 及不含防腐剂 抗生素的其它制品或稀释液 将样品直接接种 T G 小管 G A 斜面或适于本菌生长的其他培养基各 2 支 每支 0 2m1 1 支置 37 1 支置 25 另用 1 支 G P 小管 接种 0 2m1 置 25 均培养 5 日 细菌性 活疫苗应纯粹 其他制品应无菌生长 4 3 6 血液制品和混浊制品如不加防腐剂或抗生素 可直接用不加琼脂的 T G 小管和 G A 斜面 接种量 培养条件 时间和判定标准同 4 3 5 项 如加防腐剂或抗生素 检验方法和 判定同 3 4 项 4 3 7 如培养后混浊不易判定时 可移植 l 次 再判定 4 3 8 每批抽检的样品必须全部无菌或纯粹生长 如发现个别瓶有杂菌或结果可疑时 可 重检原瓶 如为安瓿或冻干制品 可重抽样品 如无菌或无杂菌生长 可作无菌或纯粹通 过 如仍有杂菌 可抽取加倍数量的样品重检 个别瓶仍有杂菌 则作为污染杂菌处理 5 安全措施 5 1 检验过程中注意防止对检验人员和环境的污染 5 2 检验人员必须穿戴工作服和口罩 5 3 滴撒在操作台 地面的异物要进行消毒处理 5 4 检验完毕后开封的检品均要经过高压灭菌处理 6 记录和计算 检品在接种相关培养基后 每天观察温箱内的培养情况并记录观察结 4 杂菌计数杂菌计数 1 技术依据及原理 某些疫 菌 苗允许有一定数量的非病原性杂菌 但这类制品如污染杂菌 必须作杂 菌计数 2 注意事项 2 1 为防止交叉污染 一个样品用一个吸管或一个注射器 2 2 各类生物制品的检验操作应在无菌条件下进行 2 3 检验过程要仔细 认真 3 材料 仪器 试剂的准备及基本要求 3 1 仪器 36 38 普通温箱 试管架 10ml 5ml 1ml 吸管 记号笔 记录纸 显微镜 3 2 培养基 含 4 血清及 0 1 裂解血球全血 马丁琼脂或酪胨琼脂培养基 G A 4 检验步骤 污染杂菌的制品至少重新抽检 3 瓶 分别进行杂菌计数 用普通肉汤或蛋白胨水 50 倍 稀释 接种于含 4 血清及 0 1 裂解血球全血的马丁琼脂平板或酪胨琼脂 G A 平板上 每个样品接种 2 付平板 放置 36 38 培养 48 小时 再放置室温 24 小时 然后分别计算 杂菌菌落 CFU 5 安全措施 5 1 检验过程中注意防止对检验人员和环境的污染 5 2 检验人员必须穿戴工作服和口罩 5 3 滴撒在操作台 地面的异物要进行消毒处理 5 4 检验完毕后开封的检品均要经过高压灭菌处理 6 记录和计算 培养 72 小时后 分别计算每个平板的杂菌数 并把两付平板的杂菌数相加后求平均数 作为该瓶的杂菌数 如污染霉菌 亦作为杂菌计算 7 结果判定 任何 1 瓶每克组织 或每头剂 的非病原菌数 不应超过所检产品的规定数量 5 支原体检验支原体检验 1 技术依据及原理 病毒性活疫苗不得含有支原体 2 注意事项 2 1 在检测中必须遵守规定的程序 每次都必须设阳性和阴性对照 2 2 对每批支原体检验用培养基进行质量检测 并作记录 2 3 操作时禁止口吹吸管 2 4 操作人员必须戴口罩 工作帽 穿工作服 禁止检验人员将头发留在帽外 2 5 保持实验室的清洁卫生 严格遵守常规的消毒制度 2 6 必须在无菌 无支原体污染的环境条件下操作 3 材料 仪器 试剂的准备及基本要求 3 1 仪器 36 38 普通温箱 36 38 二氧化碳培养箱 显微镜 试管架 10ml 5ml 2ml 1ml 吸管 小试管和 100ml 培养瓶 记号笔 记录纸 3 2 培养基 检测由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗用改良 Frey 氏培养基 检测其他种类的活疫苗用支原体培养基 4 检验步骤 4 1 样品处理 每批制品取样 3 5 瓶 混合后备用 如为冻干制品 则加液体培养基复原成混悬液后 混合 4 2 接种与观察 液体培养基培养 取 5ml 疫苗混合物接种于盛 20ml 小瓶液体培养基中 再从小瓶中 分别取 0 2m1 移植接种于 2 支小管液体培养基内 将小瓶与小管放 36 38 培养 每日观 察培养物有无颜色变黄或变红 如在 5 日尚未见变化 再从小瓶中取 0 2m1 移植于另 2 支 管液体培养基内 继续培养观察 5 日 如此重复 3 次 若仍无变化 在最后一次接种小管 的培养物经 14 天观察后停止观察 在观察期内 如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色 出现明显变化 pH 值变化达 0 5 时 应立即移植于小管液体培养基和固体培养基 观察在 液体培养基中是否出现恒定的 pH 变化 及在固体上有无典型的 煎蛋 状支原体菌落 琼脂固体平板培养 在每次液体培养物移植小管培养的同时 取培养物 0 1 0 2m1 接 种琼脂平板 2 付 放在含 5 10 二氧化碳的潮湿环境下 36 38 培养 此外 在液体培 养基颜色出现变化 pH 值变化达 0 5 时 也同时接种琼脂平板 2 付 各琼脂平板每 5 7 天在低倍显微镜下观察检查有无支原体菌落出现 经 14 天观察 仍无菌落者停止观察 4 3 每次移植培养阳性对照 在同条件下培养观察 禽类疫苗用滑液支原体作对照 非禽 类疫苗用猪鼻支原体作对照 5 安全措施 5 1 检验过程中注意防止对检验人员和环境的污染 检验完毕后开封的产品均要经过高压 灭菌处理 5 2 检验人员必须穿戴工作服和口罩 5 3 滴撒在操作台 地面的异物和污染的工作服要进行消毒处理 5 4 检验完毕 开封的检品均要经灭菌后再进行处理 6 记录和计算 检品在接种相关培养基后 每天培养情况并记录观察结果 7 结果判定 7 1 任何一次琼脂平板上出现支原体菌落 判疫苗或血清不合格 7 2 阳性对照中至少有一个平板长菌落 而阴性对照中无菌落生长 则检验有效 8 附录及附加说明 上述小瓶培养基是指 100m 小瓶中盛培养基 20m1 小管培养基是指小试管 1 0X10cm 中盛入 1 0ml 培养基 小管与小瓶皆须用胶塞或螺旋塑料塞封口 6 外源病毒检验外源病毒检验 1 技术依据及原理 由于使用的生物活性原材料 生产过程等均可引起种毒 兽用病毒性活疫苗等污染外 源病毒 因此用高效价单特异抗血清中和待检物中相应活性成分或经适当处理后 接种不 同的培养基质 观察病变以检出污染的外源病毒 2 注意事项 2 1 检验所用原材料应符合有关规定 2 2 中和用抗血清应高效价 单特异性 2 3 严格无菌操作 防止交叉污染 3 材料 仪器 试剂的准备及基本要求 3 1 仪器及设备 孵化器 CO2 培养箱 普通冰箱 普通显微镜 荧光显微镜 水浴锅 照蛋箱 3 2 试剂 特异抗血清 3 3 检验器具 小试管 试管架 注射器 1ml 吸管 1ml 5ml 10ml 记号笔 3 4 样品 每批样品 3 5 瓶 3 5 其它 检验用记录纸 笔等 4 检验步骤 4 1 样品处理 4 1 1 禽源细胞 种毒及其制品 种毒或活疫苗 除另有规定者外 液体样品取 2 3 瓶混合 冻干样品取 2 3 瓶加入 稀释液溶解后混合 用相应单特异抗血清在 25 中和 1 小时以完全中和样品中的活性成分 作为检品 除另有规定者外 病毒中和剂量为 10 羽份 4 1 2 非禽源细胞 或细胞系 种毒及其制品 种毒或活疫苗 除另有规定者外 液体样品取 2 3 瓶混合 冻干样品取 2 3 瓶加入 稀释液溶解后混合 用相应单特异抗血清在 25 中和 1 小时以完全中和样品中的活性成分 作为检品 除另有规定者外 病毒中和剂量为 1 羽份 4 2 检验方法 4 2 1 禽源细胞 种毒及其制品用鸡胚接种检查法 4 2 1 1 尿囊腔内接种试验 4 2 1 1 1 试验法 选择发育良好的 9 11 日龄 SPF 鸡胚 10 枚 每枚尿囊腔内接种 0 2ml 检品 如为疫苗 至少含 10 个羽份 在 37 培养 7 天 弃去在接种后 24 小时内死亡的鸡 胚 但鸡胚至少成活 8 10 试验方可成立 培养结束时打开鸡胚 观察鸡胚有无异常 取 尿囊液做红胞凝集试验 室温静置 15 30 分钟 观察有无红细胞凝集 4 2 1 1 2 判定 鸡胚发育正常 尿囊液红细胞凝集阴性 该批制品判合格 4 2 1 2 绒毛尿囊膜 CAM 接种试验 4 2 1 2 1 试验法 选择发育良好的 9 11 日龄 SPF 鸡胚 10 枚 每枚 CAM 上接种 0 2ml 检品 如为疫苗 至少含 10 个羽份 在 37 培养 7 天 弃去在接种后 24 小时内死亡的鸡 胚 但鸡胚至少成活 8 10 试验方可成立 培养结束时打开鸡胚 观察鸡胚及 CAM 有无 异常 取尿囊液做红胞凝集试验 室温静置 15 30 分钟 观察有无红细胞凝集 4 2 1 2 2 判定 鸡胚发育正常 CAM 无异常 尿囊液红细胞凝集阴性 该批制品判合格 5 安全措施 检验过程中注意防止人员和环境的污染 检验人员必须穿戴工作服和口罩 严格进行 无菌操作并在相应安全等级 级别 的实验室内进行 以防散毒 检验结束后对操作台 地面进行彻底消毒 用过的吸管浸泡在消毒液中 检验完毕后废弃的产品均经高压灭菌处 理 7 鉴别检验鉴别检验 1 技术依据及原理 将含有对病毒外壳或囊膜抗原的特异抗体的血清与相应疫苗病毒混合 可使两者结合 即中和 使病毒失去对其宿主的感染性 用上述中和物接种靶动物 方法 1 鸡胚 方法 2 或细胞培养 方法 3 观察其是否感染病毒 即可判断疫苗病毒与血清的特异 性 2 试验过程的注意事项 2 1 应严格无菌操作 除接种动物外 所有操作均应在生物安全试验室或超净工作台中进 行 2 2 试验前应知道疫苗病毒的含量或毒价 否则 须先行测定 2 3 两 中和 物的量要准确 中和温度要恒定 中和期间要适当摇动 并有专人值守 2 4 细胞瓶上要有标记 防止错将细胞面放反 2 5 接种动物要尽量轻柔 保定要得当 确实 以保证检验人员的安全和接种部位及接种 剂量的准确 2 6 试验完毕要及时清理现场 做好消毒处理工作 3 试验材料 仪器 试剂的准备及基本要求 3 1 仪器及设备 超净工作台 双人 垂直 恒温水浴锅 计时钟 孵化器 照蛋箱 架盘天平 恒温 培养箱或 CO2培养箱 低温冰箱 普通冰箱 倒置显微镜 3 2 试剂 特异性血清 疫苗稀释液 生理盐水 细胞培养液或适于病毒和宿主动物的其他稀释 液 无机盐类 细胞培养液 MEM 199 乳汉液 乳欧液 健康牛血清 抗生素 青 链霉素 0 25 胰酶 细胞分散液 EDTA 酚红 1 消毒剂 酒精 碘酊及脱脂棉 球等 3 3 试验器具 试管及试管架若干 吸管 1ml 5ml 10ml 注射器 1ml 5ml 10ml 及针头 4 6 蛋盘 打孔器 石腊 细胞瓶及瓶塞 3 4 试验动物 家兔 1 5 2 0kg 用于猪瘟疫苗 鸡胚 SPF 胚 9 11 日龄 用于鸡新城疫 支 气管炎疫苗 3 5 细胞 根据待检疫苗质量标准选用适宜细胞 按常规方法制备成良好单层 3 6 样品 每批疫苗任取 1 3 瓶 3 7 其他 检验记录纸 笔等 3 检验步骤 4 1 逐瓶核对疫苗及其特异性血清瓶签 分别排放于操作台上 4 2 稀释疫苗 每批疫苗任取样 1 瓶 另有规定除外 用该产品质量标准规定的稀释液 按其含量作 10 倍系列稀释至质量标准规定的稀释剂量 4 3 稀释血清 对产品质量标准规定需要稀释的特异性血清 马立克氏病特异性血清和传 染性法氏囊病特异性血清 用灭菌生理盐水作倍比稀释至该产品质量标准规定的稀释度 4 4 中和 4 4 1 打开水浴锅电源 设置温度 调整好水温 4 4 2 按其产品质量标准规定的接种量 分别计算疫苗及其特异性血清的中和用量 4 4 3 根据每批疫苗与血清的中和用量 取适宜灭菌试管 1 3 支 分别用记号笔标明 中 和 阴性对照 阳性对照 等字样 顺序排放于试管架上 产品质量标准中不设 对照 的 除外 4 4 4 取适宜吸管 定量吸取疫苗稀释液 分别加入到 中和 及 阳性对照 管中 4 4 5 取适宜吸管 吸取与疫苗稀释液等量的特异性血清 分别加入到 中和 及 阴性对照 管中 4 4 6 取适宜吸管 吸取与 疫苗 血清 等量的适当稀释液 分别加入到 阳性对照 和 阴性对照 管中 4 4 7 按其产品质量标准规定的中和温度及中和时间 核对水浴锅温度无误后 将上述试 管轻轻振摇 混匀后置水浴中和 上好定时钟 由专人值守 4 4 8 中和时间到 关闭水浴锅电源 取出试管 排放于试管架上 4 5 接种 4 5 1 接种动物 取疫苗中和物及对照物 按其产品质量标准规定的动物品种 等级 数量 年龄 体 重 接种途径 剂量 分别接种动物 4 5 2 接种鸡胚 取疫苗中和物及对照物 按其产品质量标准规定的鸡胚日龄 数量 接种途径 剂量 分别接种鸡胚 4 5 3 接种细胞 取疫苗中和物及对照物 按其产品质量标准规定的细胞种类 数量和接种量 分别接 种细胞培养 4 5 3 1 按常规方法制备细胞单层 4 5 3 2 选择生长良好的细胞 逐一轻轻幌动细胞面数次后 用酒精棉球擦拭瓶口周围 再经过酒精灯火焰瞬时烧灼 倒去细胞生长液 4 5 3 3 任取上述细胞 1 2 瓶 每瓶按原液量 用吸管换入新的细胞维持液 用记号笔标 记为 细胞对照 4 5 3 4 任取上述细胞 3 瓶 每瓶用吸管接种相当该细胞瓶生长液量 20 的疫苗中和物 用记号笔标记为 中和后 4 5 3 5 任取上述细胞 3 瓶 每瓶用吸管接种相当该细胞瓶生长液量 20 的阴性对照物 用记号笔标记为 4 5 3 6 任取上述细胞 3 瓶 每瓶用吸管接种相当该细胞瓶生长液量 20 的阳性对照物 用记号笔标记为 4 5 3 7 将接种细胞瓶按不同方向轻轻幌动数次 使接种物能均匀散布于整个细胞面上 然后 置培养箱中吸附一定时间 一般为 30 60 分钟 期间可再幌动数次 根据接种物 的特性 也可不经吸附 直接补加细胞维持液 甚或可将接种物加入定量的细胞维持液中 混匀后直接接种细胞 4 5 3 8 吸附到时 取出细胞培养瓶 按接种顺序 逐瓶补足细胞维持液 4 5 3 9 逐瓶检查瓶口是否塞紧 标记是否正确等 确认无误后 置培养箱至规定时间 4 6 蚀斑技术 适用于鸡马立克氏病活疫苗 4 6 1 按常规方法制备鸡胚成纤维细胞单层 4 6 2 选择生长良好的细胞至少 7 瓶 分别倒去细胞生长液 4 6 3 任取上述细胞 3 瓶 每瓶用吸管接种疫苗中和物 0 2ml 用记号笔标记为 中和 4 6 4 任取上述细胞 3 瓶 每瓶用吸管接种阳性对照物 用记号笔标记为 阳性对照 4 6 5 将上述接种细胞瓶移至 37 38 培养箱中吸附 1 小时 4 6 6 取出细胞瓶 每瓶用吸管补加含 2 牛血清的 199 营养液至原液量 同时 取正常 细胞 1 瓶 换以相同营养液 置 37 38 培养 24 小时 4 6 7 制备营养琼脂 糖 先取 2 的琼脂煮沸溶化后 令其降温至 46 47 再将含 5 牛血清的 199 营养液 置水浴中加热至 46 47 然后取两者等量混合即成 4 6 8 取出上述细胞瓶 倒去营养液 然后 用吸管吸取相当细胞瓶容量 1 10 的营养琼脂 糖 小心复盖在细胞层上 以不产生气泡为宜 立即平放令其凝固 4 6 9 待琼脂 糖 层凝固后 将细胞瓶倒置于 37 38 培养箱中 培养 5 7 天 4 安全措施 5 1 检验人员必须穿戴工作服 鞋 帽和口罩 必要时 还应戴上手套 5 2 滴撒在操作台 地面和试管外的检品材料 要及时擦拭消毒 5 3 用过的吸管 注射器等器具和污染 废弃物要先行消毒处理 再行清洗或丢弃 5 记录与计算 6 1 要严格按照各产品质量标准规定的观察内容和时限 仔细观察 详实记录 特别是接种动物 鸡胚的临床反应 及组织 病理变化和接种细胞的病变程度或蚀斑 数 6 2 取出细胞瓶 用肉眼观察瓶底蚀斑 接种 疫苗中和物 和 阳性对照物 的细胞应有典 型 清晰 形态不规则 边缘不整齐 直径在 0 5 1 5mm 的乳白色蚀斑 而正常细胞则 无 计数时 先用肉眼以蜡笔在瓶底点数 分别求出 3 瓶细胞的平均蚀斑数 再按下式计 算蚀斑减少率 阳性对照平均蚀斑数 样品中和平均数 蚀斑减少率 100 阳性对照平均蚀斑数 6 结果判定 按产品质量标准判定 7 1 疫苗与特异性血清中和后 接种动物或鸡胚无临床反应和组织病理变化 接种宿主细 胞不产生病变 CPE 且与 对照 其产品质量标准规定需设的 差异明显 判该特异性 血清中和试验结果阴性 即该疫苗特异 7 2 蚀斑减少率 95 的鸡马立克氏疫苗判为特异 7 附录及附加说明 8 1 如接种动物或鸡胚意外死亡 或接种细胞污染 按其产品质量标准无法判定的 应查 明原因重检 8 2 当疫苗与特异性血清中和后 接种动物 鸡胚或接种宿主细胞似有一定反应 怀疑此 疫苗未被完全中和所致 可选用更高效价的特异性血清重检 8 灭活疫苗汞类防腐剂含量测定法灭活疫苗汞类防腐剂含量测定法 1 技术依据及原理 本测定法的原理是样品加硫酸和硝酸 加热进行有机破坏 使硫柳汞的无机汞离子 在一定条件下与双硫腙生成螯合物 双硫腙的颜色由墨绿色变成黄色 滴定直到双硫腙绿 色不变 汞离子全部螯合为终点 根据样品和对照品的对照滴定可算出样品中的汞离子的 量 即硫柳汞的量 2 注意事项 2 1 二氯化汞称重至 0 1354g 是困难的 可以取接近数值 近似 0 1354g 2 2 1ml 注射器标定 用 1ml 注射器吸取蒸馏水至刻度 然后注入具塞称量瓶中 精密取 水至重量 同时测定水的温度 用以下公式计算 M1 M D M1 为注射器的实际容量 M 为称得水的重量 D 为测定温度下水的密度 g ml 如 M 0 9975 水温 20 时 D 0 99718 则注射器的实际容量 为 1 0003ml 2 3 油苗的消化是否彻底是试验关键 完全按照操作要求去做 2 4 凯氏烧瓶和分液漏斗不宜用太大的 否则影响结果和终点观察 2 5 注射器抽取样品后要直接注入凯氏烧瓶底部 不能碰到瓶颈 3 材料 3 1 仪器及设备 精密天平 烤箱等 3 2 试剂 二氯化汞 AR 盐酸羟胺 AR 硫酸 AR 硝酸 AR 双硫腙 AR 氯仿 AR 四氯化碳 AR 3 3 试验器具 称量瓶 50ml 量瓶 5ml 1ml 移液管 25ml 凯氏烧瓶 分液漏斗 125ml 1ml 注射 器 附 15mm 针头 4 检验步骤 4 1 对照品溶液的制备 精密称取硫酸干燥器中干燥至恒重的二氯化汞 0 1354g 置 100 ml 量瓶中 加 0 5mol l 硫酸溶液使溶解到刻度 摇匀 精密量取 5 ml 置 100 ml 量瓶中 用 0 5mol l 硫酸溶液稀 释至刻度 摇匀 即得 每 1 ml 溶液含有 Hg50 g 4 2 试液制备 1 0 05 双硫腙溶液 取双硫腙 50mg 加氯仿 100 ml 溶解即得 棕色瓶中冷暗处保存 2 0 00125 双硫腙溶液 取 0 05 双硫腙溶液 2 5ml 加四氯化碳稀释至 100ml 3 20 盐酸羟胺溶液 取盐酸羟胺 1g 加水至 5 ml 溶解 即得 4 0 5 mol l 硫酸溶液 取硫酸 30ml 缓缓注入适量水中 冷却至室温 加水稀释至刻度 摇匀即得 4 3 供试品的制备 油苗消化 用经标定的 1ml 注射器 附 15 cm 长针头 准确量取摇匀的供试品溶液 1ml 置 25ml 凯氏烧瓶 瓶口附小漏斗 中 加硫酸 3ml 加硝酸 1 2 0 5ml 小心加 热 待爆沸停止后