3.MTT测定细胞增值抑制率

一 试验原理 MTT 是一种粉末状化学试剂 全称为 3 4 5 dimethylthiahiazo z y1 3 5 di phenytetrazoliumromide 汉语化学名为 3 4 5 二甲基噻唑 2 2 5 二苯基四氮唑溴盐 商品名 噻唑蓝 是一种黄颜色的染料 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为 水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 Formazan 并沉积在细胞中 而死细 胞无此功能 二甲基亚砜 DMSO 能溶解细胞中的甲瓒 用酶标 仪在 490nm 波长处测定其光吸收值 在一定细胞数范围内 MTT 结 晶形成的量与细胞数成正比 根据测得的吸光度值 OD 值 来 判断活细胞数量 OD 值越大 细胞活性越强 如果是测药物毒性 则表示药物毒性越小 二 试验准备 1 MTT 的配置 MTT 一般最好现用现配 过滤后 4 避光保存两周内有效 或配 制成 5 mg ml 保存在 20 长期保存 避免反复冻融 最好小剂量 分装 用避光袋或是黑纸 锡箔纸包住避光以免分解 可把 MTT 粉末称量分装在 EP 管里 用的时候现配 当 MTT 变为灰绿色时 就绝对不能再用了 配制 MTT 时用 PBS pH 7 4 溶解 60 水浴助溶 MTT 加入细胞前还是需要以过滤的方式灭菌为宜 MTT 有致癌性 MTT 对细菌很敏感 配成的 MTT 需要无菌 往 96 孔板加 MTT 时可以把操作台及周围上的照明灯关掉 MTT 一般是过量的 所以 96 孔板中 10 uL 足够 培养基超过 100 uL MTT 按照 10 的比例加入 MTT 与培养基振荡混匀 2 DMSO 在同一实验中不要更换 DMSO DMSO 的量可为 100 uL 或 150 uL 加 DMSO 前把孔中液体尽量弃干净 否则一是沉淀会很难溶解 二 培养液的颜色在检测时也能被测到 会对最后结果造成影响 但前 提是不能把细胞结晶沉淀也一起吸掉 加了 DMSO 后用振荡器轻 轻振荡 5 10 min 时间控制尽量严格一点 放置时间长了会影响结 果 值会偏大 且结果不可信 放入 37 放孵育箱 15 min 溶解结 晶 三 实验操作 1 收集对数期细胞 调整细胞悬液浓度 每孔加入 100 uL 铺板使 待测细胞调密度至 1000 10 000 孔 边缘孔用无菌 PBS 填充 2 5 CO2 37 孵育 至细胞单层铺满孔底 96 孔平底板 加 入浓度梯度的药物 原则上 细胞贴壁后即可加药 或两小时 或 半天时间 但我们常在前一天下午铺板 次日上午加药 一般 5 7 个梯度 每孔 100 uL 设 3 5 个复孔 建议设 5 个 否则难以反 应真实情况 3 5 CO2 37 孵育 16 48 小时 倒置显微镜下观察 4 每孔加入 20 uL MTT 溶液 5 mg ml 即 0 5 MTT 继续培 养 4 h 若药物与 MTT 能够反应 可先吸弃去培养液 小心用 PBS 润洗 2 3 遍后 再加入含 MTT 的培养液 5 终止培养 小心吸去孔内培养液 6 每孔加入 150 uL 二甲基亚砜 置摇床上低速振荡 10 min 使结 晶物充分溶解 在酶联免疫检测仪 OD490 nm 570nm 处测量各孔的 吸光值 7 同时设置调零孔 培养基 MTT 二甲基亚砜 对照孔 细胞 相同浓度的药物溶解介质 培养液 MTT 二甲基亚砜 四 预实验及注意事项四 预实验及注意事项 正式试验前 要进行预实验检测其贴壁率 倍增时间以及接种不同 细胞数条件下的生长曲线 确定试验中每孔的接种细胞数和培养时 间 以保证培养终止致细胞过满 保证 MTT 结晶形成数量与细胞数 呈的线性关系 否则细胞数太多敏感性降低 太少观察不到差异 1 药物浓度的设定 一定要多看文献 参考别人的结果再定个比较 大的范围先初筛 根据初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛 否则 可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间 2 时间点的设定 在不同时间点的测定 OD 值 输入 excel 表 最 后得到不同时间点的抑制率变化情况 画出变化的曲线 曲线什 么时候变得平坦了 到了平台期 那个时间点应该就是最好的时 间点 因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显 3 培养时间 200ul 的培养液对于 10 4 105增殖期细胞来说 很难 维持 68h 如果营养不够的话 细胞会由增殖期渐渐趋向 G0 期 而趋于静止 影响结果 我们是在 48h 换液 4 MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力 不能测定细胞绝对数 做 MTT 时 尽量无菌操作 因为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值的升高 5 实验时应设置调零孔 对照孔 加药孔 调零孔加培养基 MTT 二甲基亚砜 对照孔和加药孔都要加细胞 培养基 MTT 二甲基亚砜 不同的是对照孔加溶解药物的介质 而加药 组加入不同浓度的药物 6 避免血清干扰 用含 15 胎牛血清培养液培养细胞时 高的血清 物质会影响试验孔的光吸收值 由于试验本底增加 会试验敏感 性 因此 一般选小于 10 胎牛血清的培养液进行 在呈色后 尽量吸净培养孔内残余培养液 7 接种时最好按照预实验摸索出的密度接种 因为细胞密度在 10000 ml 左右时 所测得的 OD 值的区间即细胞抑制率 或者增 值率 的所呈现的线性关系最好 结果最可信 如果铺的太稀细 胞的杀伤不会很明显 太密细胞可能都会凋亡 因为细胞长的太 快营养会不够 最后导致死亡 且而细胞过密或者过少 增殖都 会过快或者过慢 其增值率线性关系不佳 故而 MTT 细胞密度 多采用 10000 ml 100ul 孔 细胞密度要根据不同细胞的特点来 定 如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度 如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度 这 样与对照的区别更明显 数据更好 悬浮细胞每孔的细胞数可达 到 105 贴壁细胞可为 103 104 最佳点板浓度在 4000 5000 孔 太少的话 SD 值会很大 对于不同的细胞 每孔细胞数要摸索一 下 对照组 OD 在 1 4 以下为佳 当然通常来说更不要超过 2 8