移植配型的分子分型法

二、分子生物学分型法,1.RFLP与PCR-RFLP分型法 将目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶对扩增产物进行酶切，不同的基因序列会产生不同的酶切产物，从而产生不同的电泳图谱。它以简单、敏感、准确，无需同位素等优点成为目前较常用的HLA基因分型技术之一，但是无法分辨杂合子，且只能区分有限的多态性。,供者？,受者,电泳,2.PCR-SSP分型法等位基因特异性PCR 设计出一整套等位基因组特异性引物（sequence specific primer, SSP），借助PCR技术获得HLA型特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。优点是简单易行, 分辨率可从低到高, 成本低。缺点是不易自动化;不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级。,PCR-SSP分型法操作步骤 1基因DNA提取 2引物混合物的组成 3TaqDNA聚合酶 4扩增条件的选择 5电泳 6结果判断,1：阴性对照；2：为DR3；3：为DR11；4：为DR4；5:为DR1；6：为DR12；7：为DR15；8：为DR12；9：为Mark。 图：HLA-DR1、DR15阳性的杂合子电泳图谱,3PCR-SSO（PCR序列特异性寡核苷酸探针）技术分型原理是：应用位点或组间特异引物对HLA的多态区域进行PCR扩增，扩增过程中对产物进行放射性同位素或非放射性标记，根据碱基配对原则设计系列寡核苷酸探针并将其固定在膜上，PCR产物与膜上探针进行特异性杂交反应，最后通过放射自显影、显色或化学发光的信号进行结果判断。如果探针与产物DNA结合则结果阳性，反之，探针在洗膜中被洗脱，结果阴性。,4.PCR-SSCP （ PCR单链构象多态性）分型法 如果二个HLA等位基因存在点突变，经PCR扩增后进行聚丙烯酰凝胶电泳，因其序列的差异形成不同的空间构象，则电泳迁移率也不一样，如此可将它们区别开。如果供、受者的SSCP带型完全一致，则说明两者HLA基因相匹配，反之则说明不匹配。,5.SBT分型法 SBT分型法基于序列的HLA分型法(Sequence-Based HLA Typing) ，是通过对扩增后的HLA基因片段进行核酸序列测定，从而判断HLA型别的方法。 通过应用PCR-SBT技术能够清楚显示HLA基因高变区的全部碱基序列，直接可以依据基因多态性区域的测序结果进行高分辨等位基因识别，不仅可以大大提高分型的准确性，还能发现新的HLA等位基因，指导人工合成等位基因及设计新的引物或探针。,目前PCR-SSOP、PCR-SSP和PCR-SBT方法是被国际组织相容性协作组推荐的HLA分型方法，其中PCR-SBT技术更被誉为HLA分型的金标准，是迄今为止最可靠、最彻底、最准确的HLA分型方法，同时也是发现和鉴定新的HLA等位基因的主要途径，但由于其检测成本昂贵、技术复杂，且需要特定设备及详尽的软件，因而在HLA临床常规分型中较少使用。,6.基因芯片技术,我国生物芯片技术获得重大突破！由军事医学科学院放射与辐射医学研究所王升启研究员领导的课题组，与深圳益生堂生物企业有限公司联合研制的HLA-DRB1分型基因芯片试剂盒，于2005年9月获得了由国家食品药品监督管理局（SFDA）颁发的新药证书和生产文号。这是在国家自然科学基金重点项目和863计划的资助下，基因芯片技术应用的又一里程碑式的重大成果。,二、红细胞血型抗原,人红细胞血型抗原是重要的组织相容性抗原，移植前应检测供者与受者的血型是否相符，最佳选择是二者血型相同，或至少符合输血原则。输血原则：O型受者只接受O型移植物；A型受者接受A型或O型；B型受者接受B型或O型；AB型受者接受范围较广。Rh抗原应相配。,三、交叉配型,将受者和供者淋巴细胞进行混合培养（mixed lymphocyte culture, MLC），由于淋巴细胞表面富有HLA-I和HLA-II分子，若供、受者HLA抗原差异较大，彼此间将产生较大的刺激，淋巴细胞产生较强的增殖反应，细胞增殖反应的水平与供、受者间组织相容性程度呈负相关。,混合淋巴细胞培养 (体外移植模型),返回章目录,HLA氨基酸残基配型标准,鉴于目前器官移植执行的HLA六抗原无错配标准在临床实际应用中受到诸多客观条件的限制，其中最主要的是难以找到与受者HLA匹配的供者。大量临床移植病例的回顾性研究表明：HLA某些抗原对移植效果具有重要影响，而有些抗原的影响则并不重要；同样是供受HLA错配，有些错配对受者存活率影响明显，而有些影响则不明显或没有影响。,HLA氨基酸残基配型标准,HLA氨基酸残基配型标准主要依据是:在HLA分子346个氨基酸残基中对移植物排斥与存活率具有重要影响的关键氨基酸残基。当供受者的HLA关键部位氨基酸残基相同时，即使受者接受了存在HLA抗原错配的供体，但产生的移植排斥反应仍然是低反应或无反应，从而使移植物得以长期存活。目前，氨基酸残基配型标准的应用研究主要集中在肾脏移植领域，不但大幅度提高了供受者的相配几率，而且对移植物的存活率也得到显著改善。,练习题,一、填空题： 1.移植配型(又称为HLA配型/组织配型):指在器官移植中检验供受者之间_是否相配的一系列措施。目前主要检测的是ABO抗原系统和_系统。,2.组织相容性是指：器官或组织移植时供者与受者相互接受的程度，不相容就会出现_ ，诱导排斥反应的抗原称为组织相容性抗原，也称为_ 。3.目前国际上通用的器官移植配型标准是HLA-A、B和DR六抗原_标准（zero HLA-A , B , DR antigen mismatch ,0 Ag MM）。最佳的HLA配型为HLA-A、B和DR六抗原分型_ 。,4.HLA配型与移植效果最为密切的是_ ，因移植物中存在大量的淋巴免疫细胞可