细菌性食物中毒的快速检验.ppt

3 30 2020 1 细菌性食物中毒的快速检验 平山县疾控中心 3 30 2020 2 定义 食源性疾病世界卫生组织将食源性疾病定义为 凡是通过摄食而进入人体的病原体 使人体患感染性或中毒性疾病 统称为食源性疾病 3 30 2020 3 定义 食物中毒食物中毒是指人摄人了含有生物性 化学性有毒有害物质后或把有毒有害物质当作食物摄入后所出现的而非传染性的急性或亚急性疾病 属于食源性疾病的范畴 食物中毒既不包括因暴饮暴食而引起的急性胃肠炎 食源性肠道传染病 如伤寒 和寄生虫病 如囊虫病 也不包括因一次大量或者长期少量摄入某些有毒有害物质而引起的以慢性毒性为主要特征 如致畸 致癌 致突变 的疾病 3 30 2020 4 食物中毒诊断标准主要以流行病学调查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现为依据 实验室诊断是为了确定中毒的病因而进行的 食物中毒诊断标准及技术处理总则GB14938 1994 3 30 2020 5 中毒特征 3 30 2020 6 细菌性食物中毒检验 采集样品检验程序直接涂片 染色 镜检 活菌数测定 选择适当的增菌和鉴别培养基进行分离培养 生化鉴定 血清学鉴定 毒素测定 3 30 2020 7 酶联荧光免疫分析法 此E coliO157 H7的抗原鉴别是基于在VIDAS仪器内进行的酶联荧光免疫分析 像吸液管的装置是固相容器 SPR 在分析中既作为固相也作为吸液器 SPR包被有高特异的单克隆抗体混合物 将一定量的增菌肉汤加入试剂条 肉汤中的混合物在特定时间内循环于SPR内外 如果有E coliO157 H7抗原存在则与包被在SPR内的单克隆抗体结合 其他没有结合上的化合物被冲洗掉 结合有碱性磷酸酶的抗体在SPR内外循环与结合在SPR内壁上的E coliO157 H7抗原结合 最后的冲洗步骤将没有结合的接合剂冲洗掉 底物 4 甲基伞形磷酸酮被SPR壁上的酶转换成荧光产物 4 甲基伞形酮 荧光强度由光学扫描器测定 实验结果由计算机自动分析 产生基于荧光测试的试验值与标准相比较后打印出每一个被测样品的阳性或阴性结果报告 3 30 2020 8 分子生物学检验技术 聚合酶链反应聚合酶链反应是在体外酶促扩增特定DNA或RNA片段的技术由变性Templatedenaturation退火Primerannealing延伸Primerextension三个基本步骤构成 3 30 2020 9 体系组成 一段长的双链DNA 是待扩增的目的片段 作为扩增反应的原始模板 template 两段单链寡核苷酸 其序列与待扩增片段的两端相同 作为反应的引物 primer 有四种脱氧核苷三磷酸 dNTPs 作为合成DNA的原料有DNA聚合酶 polymerase 催化DNA的合成有合适的盐 缓冲液以及温度循环参数 以提供酶促反应的最佳条件并保证反应的产量 3 30 2020 10 3 30 2020 11 3 30 2020 12 3 30 2020 13 3 30 2020 14 3 30 2020 15 3 30 2020 16 在PCR体系中 相对于模板DNA 引物大量过剩 模板变性后退火时 它们以3 末端相对分别结合于模板DNA的两条互补链上 在DNA聚合酶催化下 合成新的 引物对之间的DNA片段 在第一个循环中 以两条互补的DNA为模板 从引物3 端开始延伸 其5 端是固定的 3 端则没有固定的止点 随延伸时间的增加而增长 因此该循环的产物长度是不定的 3 30 2020 17 二 PCR技术的特点 高特异性 PCR反应的特异性决定因素为 以碱基配对原则使引物与模板DNA特异正确的结合 DNA聚合酶合成反应的忠实性 靶基因的特异性与保守性 3 30 2020 18 高灵敏度 PCR产物量是以指数方式增加的 能将皮克 pg 10 12 量级的起始待测模板扩增到微克 ug 10 6 水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 在细菌的检测中 最小检出率为3个细菌 在病毒的检测中 PCR的灵敏度可达3个PFU 空斑形成单位 3 30 2020 19 PCR反应五要素的优化 1 多聚核苷酸引物2 TaqDNA聚合酶3 dNTP 三磷酸脱氧核苷酸 4 模板核酸5 缓冲液 3 30 2020 20 其它因素对PCR的影响 1 PCR反应的总体积2 PCR反应的促进剂通过加入某些物质稳定酶活性或有利于DNA的变性与复性 以提高扩增效率和反应的特异性 3 30 2020 21 稳定酶活性的有牛血清白蛋白 0 01 明胶 0 05 0 1 Tween 20及5mmol L二巯基苏糖醇 DTT 但应注意使用浓度不应过高 只有牛血清白蛋白的浓度可高达800 g ml 而对酶活性仍无抑制 5 10 的二甲基亚砜有利于DNA变性 5 10 的甘油有利于DNA复性 3 30 2020 22 注意事项 减少非特异性扩增及交叉污染 将反应管及各试剂置于冰上 以防引物与模板的非特异性结合后产生扩增 注意使用防止产生气溶胶的加样头 以避免交叉污染 最好先加入反应所需无菌水 再依次加入各成分 最后加入聚合酶及模板 3 30 2020 23 PCR产物的检测分析 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 区分小于300b的DNA片段 3 30 2020 24 3 30 2020 25 电泳缓冲液 常用的电泳缓冲液有三种 即Tris 硼酸 TBETris boricacid EDTA Tris 乙酸 TAE 和Tris 磷酸 TPE EDTA可螯合二价阳离子 从而抑制DNA酶的活性 防止PCR扩增产物被降解 3 30 2020 26 样品缓冲液 便于观察 溴酚兰在碱性溶液中呈紫兰色 在0 6 1 1 4 和2 琼脂糖凝胶电泳中 其迁移率分别与1Kb 0 6Kb 0 2Kb和0 15Kb的双链线性DNA片段相似 二甲苯腈在该溶液中呈兰色 其在1 和1 4 琼脂糖中电泳时 其迁移速率分别与2Kb和1 6Kb的双链线性DNA相近减少扩散 蔗糖或甘油使样品的比重增加 以确保DNA均匀沉入加样孔内 减少扩散 3 30 2020 27 核酸染色剂 溴化乙锭染色 溴化乙锭 ethidiumbromide EB 是一种荧光染料 EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间 在紫外线激发下 发出橘黄色荧光 EB贮备液浓度为10mg ml水溶液 应放冰箱避光保存 常用终浓度为0 5 g ml 可根据情况在制胶时加入 或者在电泳后 将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10 15min 染色后若肉眼可见核酸电泳带 其DNA量一般 5ng 当溴化乙锭太多 凝胶本底会染色过深 不易看清弱显色带时 可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察 由于溴化乙锭是一种诱变剂 使用时应戴手套 并避免环境污染 3 30 2020 28 银染色 银染色液中的银离子 Ag 可与核酸形成稳定的复合物 然后用甲醛等还原剂使Ag 还原成银颗粒 使核酸带呈黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色 也用于琼脂糖凝胶染色 其灵敏度比EB高 但缺点是银染色后 DNA不宜回收再使用 3 30 2020 29 PCR污染与对策 污染原因 1 PCR扩增产物污染 最主要最常见的污染问题 2 标本间交叉污染 主要由于盛装标本的容器被污染 加样枪污染导致标本间污染 有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶扩散 导致彼此间的污染 3 30 2020 30 防止污染的方法 1 合理分隔实验室 2 分装PCR试剂 3 防加样枪引起污染 4 选择质量好的Eppendorf管 以避免样本外溢及外来核酸的进入 打开离心管时动作要轻 以防管内液体溅出 3 30 2020 31 原则上分为四个分隔开的工作区域 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应混合物配制和扩增区 扩增产物分析区 3 30 2020 32 PCR分类 对称引物系统PCR1 经典PCR2 巢式PCR3 多重PCR4 膜结合PCR5 原位PCR 3 30 2020 33 不对称PCR 将反应系统中由于引物浓度的巨大差别 导致扩增的产物以某条单链DNA为主的PCR称为不对称PCR 两条引物的浓度相差很大 50 100 1 浓度低的称为限制性引物 浓度高的称为非限制性引物 在最初的十几个循环中 两条DNA的目的片段得到等量扩增 但后来限制性引物被消耗殆尽 只有非限制性引物尚存 扩增的产物主要为该引物引导的单链DNA 不对称PCR主要为序列测定制备单链DNA 3 30 2020 34 逆转录PCR 以RNA为模板的PCR称为逆转录PCR ReverseTranscriptasePCR RT PCR 与前述PCR的不同之处在于首先需在一单引物的介导和逆转录酶的催化下 合成RNA的互补链 该互补链称为cDNA 通过加热使逆转录酶失活后 加入另一引物 再以该cDNA为模板 在DNA聚合酶催化下合成目的双链DNA片段 逆转录PCR的模板可为细胞 病毒的总RNA或细胞mRNA 该方法常用于检测RNA病毒或研究真核细胞的基因表达 3 30 2020 35 标记引物PCR 是利用荧光素 同位素或生物素等对PCR引物的5 端进行标记 通过检测荧光素或者同位素 直接显示产物的存在 或者利用生物素 亲合素系统与酶促反应结合 借助酶促反应的放大效应 显示目的片段的存在 更加提高PCR的灵敏度 3 30 2020 36 不同荧光素标记不同引物 彩色PCRPCR ELISA法 个引物的5 端 使其携带便于PCR产物固定于微孔板的的功能基团 如生物素 而另一引物或者探针的5 端修饰便于用酶连免疫吸附试验检测的基团如FITC 经此修饰后的引物仍能引导PCR的特异扩增反应 扩增后的产物不需电泳 直接加入链霉亲合素包被的聚丙乙烯微孔板 通过生物素与链霉亲合素反应 使产物以及生物素修饰的游离引物固定于微孔板 但只有产物可与随后加入的HRP 抗FITC抗体结合 借助检测酶活性反映PCR产物的多少 3 30 2020 37 免疫PCR 是将抗原抗体的特异性反应与PCR技术结合起来 以检测微量蛋白质的方法 如 将与被检物对应的单克隆抗体先吸附在固相载体上 然后使被检抗原与之反应 再用生物素化的特异性多抗结合此抗原 通过亲合素再与生物素化DNA相连结 再以适当的引物对DNA指示分子进行扩增 以扩增产物的有无与多少 反应待测抗原的存在与数量 3 30 2020 38 定量PCR 3 30 2020 39 实时荧光定量PCR技术 是指在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 3 30 2020 40 1 Ct值的定义在荧光定量PCR技术中 有一个很重要的概念 Ct值 其含义是 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 3 30 2020 41 2 荧光域值 threshold 的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 3 30 2020 42 3 Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 起始拷贝数越多 Ct值越小 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 其中横坐标代表起始拷贝数的对数 纵坐标代Ct值 因此 只要获得未知样品的Ct值 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数 3 30 2020 43 TaqMan荧光探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针 该探针为一寡核苷酸 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团 探针完整时 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 PCR扩增时 Taq酶的5 3 外切酶活性将探针酶切降解 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离 从而荧光监测系统可接收到荧光信号 即每扩增一条DNA链 就有一个荧光分子形成 实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 3 30 2020 44 在PCR反应体系中 加入过量SYBR荧光染料 SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后 发射荧光信号 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步 3 30 2020 45 3 30 2020 46 3 30 2020 47 荧光定量标准曲线 3 30 2020 48 总结 细菌性食物中毒的判断很重要诊断标准主要以流行病学调查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现为依据 实验室诊断是为了确定中毒的病因而进行