碱裂解法提取质粒ppt课件.ppt

碱裂解法提取质粒DNA 1 通过质粒的一些特性 质粒DNA的提取 测定 学习用碱变性法提取质粒DNA的方法 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理及操作 一 实验目的 2 质粒 Plasmid 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子 能稳定地独立存在于染色体外 并传递到子代 一般不整合到宿主染色体上 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在 存在于细菌 放线菌 真菌以及一些动植物细胞中 在细菌细胞中最多 二 实验原理 3 4 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子 具有以下特点 易于鉴定 在受体细胞中可以独立复制 易于筛选 易于导入受体细胞 5 二 实验原理 6 SDS是一种阴离子表面活性剂 它既能使细菌细胞裂解 又能使一些蛋白质变性 所以SDS处理细菌细胞后 会导致细菌细胞壁的破裂 从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来 释放出来的DNA遇到强碱性 NaOH 环境 就会变性 然后 用酸性乙酸钾来中和溶液 使溶液处于中性 质粒DNA将迅速复性 而基因组DNA 由于分子巨大 难以复性 离心后 质粒DNA将在上清中 而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部 通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来 7 三 主要试剂及作用 溶液 由葡萄糖 EDTA Tris HCl组成 保护 缓冲 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度 减少抽提过程中的机械剪切作用 防止破坏质粒 保护作用 EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子 防止DNA酶对质粒分子的降解作用 保护作用 Tris HCl使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围 缓冲作用 8 8 溶液II 由SDS 十二烷基硫酸钠 与NaOH组成 裂解 变性 SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性 裂解细胞和蛋白质变性作用 NaOH PH 12 的作用是破坏氢键 使DNA分子变性 DNA变性作用 9 9 溶液III HAc和KAc组成的高盐溶液 复性 分离 HAc溶液能中和溶液 的碱性 使染色体DNA变性而发生缠绕 并使质粒DNA复性 KAc会与SDS形成溶解度很低的盐 并与蛋白质形成沉淀而除去 溶液中的DNA也会与蛋白质 SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离 10 四 试剂配制溶液 50mM葡萄糖 25mMTris HCl pH8 0 10mMEDTA pH8 0 1MTris HCl pH8 0 12 5ml 0 5MEDTA pH8 0 10ml 葡萄糖4 730g 加ddH2O至500ml 高压灭菌15min 贮存于4 溶液 0 2NNaOH 1 SDS 2NNaOH1ml 10 SDS1ml 加ddH2O至10ml 使用前临时配置 3 溶液 醋酸钾 KAc 缓冲液 pH4 8 5MKAc300ml 冰醋酸57 5ml 加ddH2O至500ml 4 保存备用 11 4 TE 10mMTris HCl pH8 0 1mMEDTA pH8 0 1MTris HCl pH8 0 1ml 0 5MEDTA pH8 0 0 2ml 加ddH2O至100ml 15lbf in2高压湿热灭菌20min 4 保存备用 5 苯酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 6 乙醇 无水乙醇 70 乙醇 7 5 TBE Tris碱54g 硼酸27 5g EDTA Na2 2H2O4 65g 加ddH2O至1000ml 15lbf in2高压湿热灭菌20min 4 保存备用 8 RNaseA RNA酶A 不含DNA酶 DNase free RNaseA的10mg ml TE配制 沸水加热15min 分装后贮存于 20 12 实验步骤 加1 5ml培养物于EP管 12000g 30S除去上清 加入冰的200 l溶液I 剧烈振荡EP管 室温3min加入300 l溶液II 快速颠倒数次 冰浴3min加入400 l冰溶液III 温和振荡10s 冰浴5min 12000g 5min转移上清到新EP管 加入等体积酚 氯仿 1 1 温和振荡 冰浴3min 12000g 5min上层水相转移到新EP管 加入2倍体积无水乙醇 颠倒混匀 20 冰箱中放置15min 12000g 10min弃上清