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文档简介

碱性磷酸酶的提取鉴定 朱 金 王 何 1 碱性磷酸酶 广泛存在于微生物界和动物界 碱性磷酸酶能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应 产生无机磷酸和相应的醇 酚或糖 它也可以催化磷酸基团的转移反应 磷酸基团从磷酸酯转移到醇 酚或糖等磷酸受体上 2 如何获取碱性磷酸酶 碱性磷酸酶 AKP 溶于30 乙醇或33 丙酮 但在60 的乙醇或50 丙酮中则形成沉淀 通过离心可以使AKP和其他蛋白分离 从而得到纯化 反复进行纯化的操作 可以获得较高纯度的AKP 3 1 综合运用有机溶剂沉淀 离心 分光等方法 从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质的技能 2 掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及鉴定的方法 实验目的 4 实验原理 碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠 使之水解生成酚和磷酸盐 酚在碱性溶液中与4 氨基安替比林作用 经铁氰化钾氧化形成红色醌类衍生物 其颜色深浅与AKP活性成正比 5 碱性磷酸酶的提取 称取兔肝2g 剪碎后置于玻璃匀浆器中 加入0 01mol L的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml 进行匀浆 将其转入离心管 并加2ml0 01mol L的醋酸镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器 之后将之倒入离心管 与原来的匀浆液混合 记录体积a 取0 1ml作为A液于EP管 待测比活性用 6 碱性磷酸酶的提取 在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇 玻璃棒搅拌2min 室温放置30min 纱布过滤 置于离心管 7 碱性磷酸酶的纯化 滤液加入等体积的冷丙酮 边倒边摇 混匀后3000r min5min 弃上清 沉淀用4ml0 5mol LMg AC 2溶解 记录体积b 取0 1ml作为B液于EP管 待测比活性用 在悬液中缓慢加入冷95 乙醇使其终体积为30 0 46体积 混匀后2000r min5min 转移上清液于另一离心管 上清液中缓慢加入冷95 乙醇使其终体积为60 0 85体积 混匀后3000r min5min 沉淀用4ml0 01MMg AC 2 NaAC混合液搅拌混悬 8 碱性磷酸酶的纯化 其余悬液中缓慢加入冷丙酮 使得丙酮的体积分数达到33 0 5体积 混匀后2000r min离心5min 取上清液丢弃沉淀 上清液中缓慢加入冷丙酮 使丙酮终体积分数达到50 0 34体积 混匀后3000r min离心15min 沉淀中加入Tris 醋酸镁缓冲液5ml 即为纯化酶液 作为D液用于比活性测定 9 10 碱性磷酸酶活性的鉴定 磷酸苯二钠磷酸盐 酚酚 4 氨基安替比林红色醌类衍生物AKP是一种底物特异性较低 在碱性环境中能水解磷酸基团 最适pH范围为8 8 10 需要镁离子作为激活剂 AKP 铁氰化钾 11 12 13 加入底物后 立即混匀 37 准确15min后加入0 5 铁氰化钾2 0ml终止反应 混匀 静置15min 510nm比色 14 酶活性单位 U ml A样 A标 0 1 稀释倍数 15 蛋白质含量测
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