槐花药材的含量测定及方法学验证实验报告

槐花药材的含量测定及方法学验证槐花药材的含量测定及方法学验证 姓名 廖卓姓名 廖卓 学号学号 11071105 一 实验目的一 实验目的 1 掌握比色法测定槐花药材中总黄酮含量的方法及原理 2 熟悉槐花药材的含量测定的方法学验证 二 实验原理二 实验原理 槐花为豆科植物 SophorajaponicaL 的干燥花及花蕾 1 夏季花开放或花蕾形成时采 收 及时干燥 除去枝 梗及杂质 前者习称 槐花 后者习称 槐米 槐花药材 的主要有效成份是黄酮类化合物 其中芦丁的含量最高 所以槐花药材的鉴别及含 量测定均以芦丁为指标成分 芦丁 C27H30O16 610 51 黄酮类化合物在碱性条件下与铝盐发生配位反应 生成红色的配位化合物 使得最 大吸收波长红移至可见光区 且具有较高的吸收系数 黄酮类与铝盐的配位反应是 定量完成的 因此可采用比色法测定槐花药材中总黄酮的含量 避免其他非黄酮成 分对测定准确度的影响 2 三 仪器与试药三 仪器与试药 仪器 紫外 可见分光光度计 100ml 容量瓶 25ml 容量瓶 10ml 移液管 超声波 清洗器 漏斗 玻璃棒 试剂 槐花药材 芦丁对照品 5 亚硝酸钠溶液 10 硝酸铝溶液 氢氧化钠试 液 乙醇 四 实验步骤四 实验步骤 总黄酮含量测定总黄酮含量测定 1 对照品溶液的制备 对照品溶液的制备 取芦丁对照品 50mg 精密称定 置于 25ml 量瓶中 加 60 乙醇适量 置水 浴上微热使溶解 放冷 加 60 乙醇至刻度 摇匀 精密量取 10ml 置于 100ml 量 瓶中 加水至刻度 摇匀 即得浓度为 0 2mg ml 的芦丁对照品溶液 2 检测波长的选择 检测波长的选择 取 A 对照品溶液 在 400 600nm 波长进行光谱扫描 发现光谱图最大吸收 选定波长 说明 一般选择待测样品化合物吸收度最大 即吸收曲线最高点为测定波长 化合物的最大吸收峰 max 或该化合物经显色后的最大吸收峰 通过分光光度计 进行扫描后确定或通过二极管阵列检测来确定 并与该化合物文献值相比较应一致 在最大吸收峰处测定时灵敏度高 误差小 因此一般情况下选择最大吸收波长作为 检测波长 3 标准曲线的制备 标准曲线的制备 配制不同浓度的 A 对照品溶液 考察线进样量与峰面积的性关系 线性范围 相 关系数等 以进样量为横坐标峰面积为纵坐标做标准曲线 标准曲线的制备步骤 精密量取对照品溶液 1ml 2ml 3ml 4ml 5ml 与 6ml 分别置于 6 个 25ml 量瓶 中 各加水使成 6 0ml 精密加 5 亚硝酸钠溶液 1 0ml 摇匀 放置 6 分钟 再加 10 硝酸铝溶液 1 0ml 摇匀 放置 6 分钟 加氢氧化钠试液 10 0ml 加水稀释至 刻度 摇匀 放置 15 分钟 不加对照品溶液同法配制空白溶液 按照紫外可见分 光光度法 在 500nm 波长处测定各溶液的吸光度 以浓度为横坐标 吸光度为纵 坐标 绘制标准曲线 浓度 C mg ml 0 000 0 008 0 016 0 024 0 032 0 040 0 048 吸光度 A 4 供试品溶液的制备 供试品溶液的制备 将槐花研碎 取粗粉约 1g 精密称定 置于具塞锥形瓶中 加 60 乙醇 120ml 60 C 超声 30 分钟 摇匀 过滤 取续滤液 10ml 置 100ml 量瓶中 加水 稀释至刻度 摇匀 作为供试品溶液 5 测定法 测定法 精密量取供试品溶液 3ml 置 25ml 量瓶中 按照标准曲线制备项下方法 自 加水使成 6 0ml 起同法测定吸光度 由标准曲线计算出供试品溶液中含芦丁的重 量 槐花按干燥品计算 含总黄酮以芦丁 C27H30O16 计 槐花不得少于 8 0 槐米不得少于 20 0 样品浓度 C mg ml 1 2 3 平均值 吸光度 A 浓度 C mg ml 百分含量 五 方法学考察五 方法学考察 1 加样回收试验 加样回收试验 一般回收率要求在 95 0 105 0 详解 加样回收试验即于已知被测成分含量的成药中再精密加入一定量的被测 成分纯品 依法测定 用实测值与原样品中含测成分之差 除以加入纯品量计算回 收率 此法不用制备空白对照 模拟真实性好 加样回收试验操作方法 取样品 6 份精密称定每份 0 5g 精密加入芦丁对照品 适 同按照供试品溶液的制备法和测定法步骤在 500nm 波长处测定各浓度的吸光 度 计算含量 100 加入对照品含量 实验前样品含量实验测得量 回收率 注意事项 1 纯品的加人量与取样量中被测成分之和必须在标淮曲线线 性关系范围之内 2 外加纯品的量要适当 过小则引起较大的相对误差 过 大则干扰成分相对减少 真实性差 3 一般加入量与所取样品含量之比控制 在 1 1 左右 4 做加样试验时 有人将对照品加至制备好的供试品溶液中 这是不对的 这样不能考察提取 纯化过程中被测成分是否损失 不能代表含量测定方法的回收 率 因此要在称样开始时就加入对照品 分组 吸光度 加入对照品 实验前样 实验测得样 回收率 平均回收率 A 含量 mg 品含量 mg 品含量 mg 1 2 3 4 5 6 2 精密度试验 精密度试验 是指用相同方法对同一样品溶液进行多次测定 考察各测定值彼 此接近的程度 具体如下 取同一样品 连续测定五次 相对标准偏差 RSD 不 得大于 3 0 具体如下 精密度试验操作方法 取同一槐花样品溶液 5 ml 在 500 nm 处测吸光度 重复测定 5 次 算出 RSD 测试次数 1 2 3 4 5 吸光度 A 3 重复性试验 重复性试验 是指在同一条件下对同一批样品 从样品供试品液制备始 制备 多份供试品溶液 每份供试品液再分别进行测定 测定所得到的数据进行统计学处 理 计算其含量的平均值和相对标准偏差 RSD 具体如下 同一批号样品 分别取低 中 高三个样品量 每个样品量 3 份 按样品测定方法操作 或在规定 范围内 取同一浓度的供试品 用 6 个测定结果进行评价 相对标准偏差 RSD 不得大于 2 0 重复性实验操作方法 精密称取药材样品 1g 精密称定 共 6 份 按供试 品制备方法制成供试品溶液按测定法分别在 500nm 波长处测定各溶液的吸光度 由标准曲线计算出供试品溶液中含芦丁的重量 ug 并求 RSD 值 样品 1 2 3 4 5 6 吸光度 A 含量 ug 4 稳定性试验 稳定性试验 考察不同时间点是否对测定方法和测定结果有影响 用同一被测 样品的供试液在不同间隔时间用同一测定方法所得到的测定结果 一般考察 36 小 时 这里考察 60min 计算 RSD 不得大于 3 0 对照和样品均要做 稳定性实验操作方法 取芦丁对照品和样品溶液 5ml 于 0 15 30 45 60 min 测定吸光值 计算吸光度平均值 求出 RSD 判断样品的稳定性 时间 min 0 15 30 45 60 平均值 吸光度 A 六 总结六 总结 七 注意事项七 注意事项 1 比色法中显色反应及条件对形成的稳定配位化合物有一定影响 因此实验中需要遵守平行操作原则 如配置标准系列溶液时 空白与标准系列溶液 中加入各种反应试剂的量 顺序 反应时间与温度等操作步骤均应保证平行 所有 加入的反应试剂均应使用刻度吸量管精密量取 准确加入 2 注意吸收池 比色皿 的配比使用 八 附录八 附录 1 实验试剂配制实验试剂配制 1 5 亚硝酸钠溶液 取 2