HE组织切片制备标准操作程序

HEHE 染色标准化操作程序染色标准化操作程序 一 目的一 目的 保证病理切片质量 以达到准确的病理诊断 二 范围二 范围 石蜡包埋组织 三 试剂 仪器三 试剂 仪器 酒精 二甲苯 苏木素 伊红 盐酸酒精 脱水机 包埋机 切片机 漂烘仪 染色机 四 工作流程四 工作流程 一 制片前 一 制片前 制片前过程从标本送到实验室至包埋结束为止 包括 1 1 标本的交接编号记录及检查标本的交接编号记录及检查 1 实验室人员收检标本时人必须认真执行查对制度 包括 送检标本种类和 数量与送检单上填写的是否一致 容器上的联号或姓名与送检单上是否符合 固定 液的种类 通常要求为 10 中性缓冲甲醛液 和量是否符合要求 送检单是否按规 定用墨水笔逐项填写清楚 若发现有错误 疑问或不符合要求时 应立即查询清楚 和适当处理 在合格后方可签名接收 如标本已干涸 腐败或其它明显不符则不应 接收 接收标本应在初级人员接收后 再由中级人员和主检或具体负责人员复核 以确保没有差错发生 2 收到标本后应按标本顺序逐一在申请单上编上病理检查号 并在标本容器 外壁贴上相应的号码 然后按号码先后顺序排列放好 再在申请单上打上收到日期 将收检的标本 按申请单逐一向负责处理的医师交代清楚 包括标本种类 数量 临床诊断及有无特殊注意事项等 3 取检过程中 实验室人员应认真记录填写好工作单 包括标本号 块 包 数 有无特殊处理 标本名称 如标本全取 标本过小等均应记录在案以备日后查 对 对一些易碎 小而少的标本应用尼龙丝小袋或擦镜纸包裹好后再做上机处理 以防丢失 标本的取材块通常控制在 2cm 2cm 0 3cm 左右 标本取检多于一个包 埋块者 在标本病理检查号后缀写 1 或 2 等 以便于查找校对 取好的标本应及时 浸泡在指定的固定液中 来不及取完的标本特别是大标本应缝上号码投入固定池内 以备次日再取 标本取检完后 自报告发出之日起 通常规定小标本保留 1 月以上 大标本保留 6 月以上 4 标本在上机处理之前 必须由初级和中级实验技术人员共同检查标本总数 与申请单和工作单是否一致 确定无疑后方可上机处理 2 2 标本的处理标本的处理 利用全自动脱水机处理 根据组织的大小 分类分别设置程序 所有试剂由专人负责定时检测定期更换 并做好详细记录 3 3 标本的包埋标本的包埋 首先清点检查标本 确认完好无缺后方可开始包埋操作 操作时应注意核对标 本与工作单记录是否吻合 包埋的石蜡温度应尽量与标本浸蜡温度一致 大约控制 在 65 70 之间 温度太低会造成包埋平面凹凸不平 尤其是内镜活检等小块标 本 易出现切片不完整而发生漏诊现象 包埋时 先取大小合适的不锈钢模型 注入蜡液置于热台上 液面刚好与模型的上 缘平齐 不得低于或高于此限 取出包埋盒内的组织 校对正确后用干净的热镊子 将所有组织悉数放入模型的底部 待组织与模型内的蜡液充分融合后 按要求排列 后迅速移动模型至冷台 至底部石蜡刚开始凝固 用镊子轻压组织数秒 待组织埋 平后 迅速盖上包埋盒注上蜡液 约过 10s 15s 包埋盒与模型周边的蜡液凝固 后 再次补充注入少许蜡液 以增加包埋盒的稳固性 注意液面高度不得高于包埋 盒上缘 加盖包埋盒时一定要保持与模型底部平面平行 无前后左右倾斜的现象 待蜡块在冷冻台彻底冷却后 从模型内取出修去包埋盒周边多余的石蜡 清点包埋 好的蜡块总数 按大小类别放好 冷冻备切 二 切片 二 切片 1 将切片刀安装在持刀座上 2 将蜡块固定于支持器上 3 细心移动刀座或蜡块支持器 使蜡块与刀刃接近 旋紧刀座 观察蜡块面 是否与刀座相平 如不平须调节支持器 使蜡块面与刀面平行 4 修块 粗切 用右手匀速旋转切片机轮 修切蜡块表面至包埋其中的组织 块全部切到 修块粗切片的厚度为 15 20 微米 注意 对于医嘱再次深切片特别是 在原切片中发现了有意义病变而进行的深切片应尽量少修块 以尽量好地获得有关 病变的连续性 5 调节切片厚度调节器 一般为 2 4 微米 进行切片 切出的蜡片应连续成 带状 完整无缺 厚度适宜 3 5 微米 均匀 无刀痕 颤痕 皱褶 开裂 缺损 松解等 6 以专用镊子轻轻夹取完整 无刀痕 厚薄均匀 干净的蜡片 放入漂片机的 温水中 40 50 左右 使切片全面展开 每切完一个蜡块后必须认真清理水面 不得遗留其它病例的组织碎片以免污染 7 将蜡片附贴于处理过的载玻片上 蜡片应放在载玻片右 2 3 处的中央 留出 载玻片左 1 3 的位置用于贴附标签 蜡片与载玻片之间无气泡 为防止蜡片滑落 蜡片的一角 远离组织的 可粘在载玻片边缘上 若一片载玻片上捞两片以上的蜡 片 必须把蜡片均匀贴附在载玻片上 保持制片的美观 8 必须立即在置放了蜡片的载玻片一端 待贴标签处 用铅笔准确清楚地标 记其相应的病理号 包括次级号 外借白片 需在每张白片上注明对应的病理号 9 将置放了蜡片的载玻片呈 45 度斜置片刻 待载玻上的水分流下后 将其插 入专用的染色架中 最后置于恒温箱中烘烤 72 左右 15 分钟 然后即可进行染 色 10 切片注意事项 1 切片前蜡块要冷冻 这样容易切片 甲状腺 淋巴结及胃镜等特殊组织 必须控制冰冻时间 2 如遇难切的蜡片时 可用与蜡块切面差不多大小的薄纸潮湿后贴在蜡块上 切片 然后将附有蜡片的一面朝上放入水中漂片 3 如遇易脱片组织 如血凝块 脑组织 时 可用多聚赖氨酸或 APES 处理 过的玻片来捞片 4 总是切不出完整的蜡片 或皱缩或卷片 可能是刀不利 5 切出的蜡片总是皱缩 可能是蜡块冷冻时间不够 或是组织脱水 浸蜡效 果不好 6 切片厚薄不匀或空片 可能是刀未固定紧或蜡块未夹紧 也可能是切片机 有问题 7 烤片时间与温度有关 一般时间宁长勿短 否则会造成脱片 一般烤片温 度控制在 62 时间为 30min 左右 8 连续切片放入热水漂片时 不要捞取第一 二张蜡片 因为前 2 张蜡片厚 组织有空洞 镜下可见 9 用于展片漂片仪的温水必须认真清理水面 不得遗留其它病例的组织碎片 以免污染 三 三 HEHE 染色染色 1 自动染色 见 染色机使用及维护标准操作程序 2 手工染色 1 脱蜡 二甲苯 5 分钟 二甲苯 5 分钟 100 酒精 1 分钟 100 酒精 1 分钟 95 酒精 1 分钟 80 酒精 1 分钟 自来水浸洗 1 分钟 2 染色 苏木素染液 6 分钟 水冼 1 分钟 0 5 1 盐酸酒精分化片刻 颜色由蓝变红即可 自来水冲冼 10 分钟左右 颜色由红变蓝 然后 95 酒精片刻 主要是避免 所带的水份稀释以下的伊红酒精 此步可免 伊红染液浸染 3 脱水 透明 封固 75 酒精 0 5 分钟 85 酒精 1 分钟 95 酒精 1 分钟 100 酒精 1 分钟 100 酒精 1 分钟 石炭酸二甲苯 1 3 10 秒钟 二甲苯 透明 1 分钟 二甲苯 透明 1 分钟 取出后用中性树胶封固 3 H E 染色注意事项 1 二甲苯脱蜡时间冬季长些 夏季可短些 为防止脱蜡不净影响染色 脱蜡 时间宁长勿短 2 盐酸酒精分化时间灵活掌握 可以在切片蓝化后镜下观察 3 染色后的脱水透明也很重要 若脱水不完全 切片会模糊不清 脱水的 乙醇要保持纯度 切片在进入脱水乙醇前尽量把水份去掉 4 结束染色的切片用中性树胶封固 操作时用滤纸轻轻吸去组织周围的液体 保持组织切片的轻度湿润 滴少许树胶 用镊子取盖玻片轻轻盖上 注意封片时不 能让组织切片干涸 否则会出现人为色素即 中性树胶色素 封片动作要轻 以 防产生气泡或溢胶 树胶浓度要适当 预先可用二甲苯调试好备用 太稠不宜操作 太稀易出现气泡或溢胶 四 制片后 四 制片后 制片后过程由封固切片结束到上交切片为止 1 封固好的切片 由初级实验技术人员按号码顺序排放在切片夹内 与相应的蜡 块进行校对 检查切片与蜡块的号码是否一致 有无错号 检查切片与蜡块中组织 的形状是否一致 是否切全 仔细粘贴标签后交上级人员复查 2 上级人员根据申请单或工作单上的记录全面仔细检查切片 评分内容 标准及 其分值如下 外观 5 分 清洁 无溢胶 载玻片及盖玻片完整 标签 5 分 清洁 号码清晰 粘贴牢固 贴在指定位置 裱片 5 分 组织裱贴在适当位置上 方向合适 厚薄 5 分 切片厚薄均匀一致 平整 7 分 切片平整无皱折 切痕 8 分 切片完整 无破裂或划痕 透明 10 分 切片透明 无云雾状 组织固定脱水彻底 颜色 18 分 核浆着色正 对比度清晰明显 层次 气泡 5 分 染色有层次 深浅分明 无气泡 细胞形态 12 分 无挤压 皱缩及膨胀变形 污染 15 分 无异物或其它组织混入切片 洁净度 5 分 玻片内无残留染料 如有上述不合格项目 按评分表格标准扣分 总分为 100 分 90 分以上为甲级 片 90 分 80 分