细菌耐药表型的检测方法.ppt

细菌耐药表型的检测方法 细菌耐药表型的检测 一 内酰胺酶的检测 1 头孢硝基噻吩显色法 Nitrocefin 制配纸片 灭菌水湿润 涂测试菌于纸片上 10min观察纸片颜色 显红色为阳性 葡萄球菌应放置1h内观察 2 酸度法 青霉素 内酰胺酶水解 青霉酸 pH6 8以下 酚红指示剂由红色 构橼酸钠缓冲液pH8 5 变为黄色 3 碘测定法 内酰胺酶破坏 内酰胺环 碘与破坏后的 内酰胺结合 使兰色的淀粉 碘复合物转变成无色 4 仪器测定法 Vitek Microscan的药物测试卡中均带有检酶功能 二 ESBLS检测 1 纸片扩散初筛 头孢他啶 30 g 片 抑菌圈 22mm头孢噻肟 30 g 片 抑菌圈 27mm头孢曲松 30 g 片 抑菌圈 25mm氨曲南 30 g 片 抑菌圈 27mm 2 肉汤稀释法 上述药物MIC 2 g ml可疑为ESBLS 表型确证试验 对2个任何一个药物MIC 在加克位维酸比不加克拉维酸的MIC值降低3个以上对倍稀释度判为ESBLS 3 双纸片协同确认试验 头孢他啶 30 g 片 与头孢他啶 30 g 克位维酸 10 g 头孢噻肟 30 g 片 与头孢噻肟 30 g 克拉维酸 10 g 两纸片抑菌圈相比 5mm即为ESBLS 4 E test法 浓度梯度法 由瑞典ABBiodisk公司研究生产 广洲贝肯公司经销 试条中的三代头孢菌素或氨曲南的MIC 2 g ml即可疑为ESBLS 5 仪器测定法 Vitek microscan和BD PHOEMXTM微生物分析仪均可测试ESBLS 6 利用分子生物学技术 PCR DNA探针等 及分析酶底物谱及抑制物谱 生物化学技术等检测技术可对ESBLS做出确诊 三 Ampc酶检测1 初筛 1 头孢西汀 30 g 片 与头孢西汀 30 g 邻氯西林 200 g 后者比前者的抑菌圈 5mm即疑为Ampc 2 5种纸片筛选 马斯平 泰能 头孢西汀 头孢他啶与头孢他啶 克拉维酸 如头孢西汀 18mm 对马斯平 泰能敏感即疑为产Ampc 如头孢他啶与其酶抑制剂的抑菌圈 5mm可能产ESBLS 2 确认试验 头孢西汀三维水相试验法 AmpC酶新的检测方法 3 三维水相试验方法的改进 1 将标准菌株ATCC25922按常规药敏纸片K B法操作均匀涂布于M H平板上 2 在M H平板中心贴一片头孢西汀 30ug 片 纸片 在距纸片边缘1cm处 用无菌手术刀片切3cm长度的小槽 将待测菌株的6个菌落接种于槽内 勿溢出槽外 35 孵育18 24h 3 结果观察 若抑菌圈向内凹陷 即AmpC酶阳性 三维水相试验方法的改进 M H平板打孔 2mm 扩散法 AmpC酶新的检测方法 4 质粒型AmpC酶三联纸片方法的检测 1 将标准菌株ATCC25922按常规药敏纸片K B法操作均匀涂布于M H平板上 2 在M H平板中心贴一片头孢西汀 30ug 片 纸片 在纸片边缘贴有待测菌的纸片 纸片上含20ul PH8 0 1MTris 0 1MEDTA 3 另一侧边缘贴有产AmpC酶菌的纸片 同上 4 35 孵育18 24h 如待检菌出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性 四 金属 内酰胺酶的表型检测方法 1 头孢他啶 2 巯基丙酸法 CAZ NCA 1 将待测菌株按常规药敏纸片K B法操作均匀涂布于M H平板上 2 在M H平板上分别贴两片头孢他啶 30ug 片 纸片 纸片中心相距2 5cm 将其中一片头孢他啶纸片上加3ul2 巯基丙酸 35 孵育18 24h 3 结果观察 若加有2 巯基乙酸的头孢他啶纸片抑菌圈大于单个头孢他啶的抑菌圈 4mm 则为阳性 即产金属 内酰胺酶 金属 内酰胺酶的表型检测方法 2 亚胺培南 EDTA法 IMP EDTA 1 将待测菌株按常规药敏纸片K B法操作均匀涂布于M H平板上 2 在M H平板上贴一片亚胺培南 10ug 片 纸片 在距亚胺培南纸片中心1 5cm处贴无菌空白纸片一片 将0 5MEDTA10ul均匀浸注于空白纸片上 35 孵育18 24h 3 结果观察 若两片纸片抑菌圈有协同作用 则为阳性 即产金属 内酰胺酶 五 肠杆菌科碳青霉烯霉筛选和确证 2009年CLSI M100 S19 APPB 124 1 如果菌株对碳青霉烯类药物表现为 I 或 R 没必要再去检验该酶 医生通常不会选用 I 或 R 的药物 但主要以感染控制为目的检验该酶 2 什么是碳青霉烯酶 一类能水解或灭活碳青霉烯类抗生素的酶 如 KPC 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶 碳青霉烯类抗生素 Doripenem 目前无CLSI折点 厄他培南 亚胺培南 美洛培南 3 肠杆菌科碳青霉烯敏感及碳青霉烯酶筛选的折点 亚胺培南不用于变形 普罗威登 摩根菌属中碳青霉烯酶的筛选 因为这些菌属会产生非碳青霉烯酶导致的亚胺培南MIC升高 NA 不可用 本试验不适用于筛查 4 什么时候做改良Hodge试验 如果头孢噻肟 头孢他啶和 或头孢曲松全部 R 注 头孢比肟对于碳青霉烯酶产生株的结果是不稳定的 MIC g ml 抑菌圈 mm 厄他培南219 21亚胺培南 2 4NA 美洛培南2 416 215 做改良的Hodge试验 确证试验 1 ATCC25922配成0 5麦氏浊度 1 10稀释 2 用棉签满涂布于MH平板上 就像纸片扩散法药敏试验一样 在中心加一张厄他培南或美洛培南 最好 纸片 3 取待测菌 1 3号 从纸片边缘向外划 用1 l接种环 4 35 培养过夜后 观察结果 5 大肠沿着菌株划线的生长表明碳青霉烯水解酶的产生 6 改良的Hodge试验 检测碳青霉烯酶活性的表型试验 在检测KPC方面有 90 的敏感性 特异性 检测其他碳青霉烯酶时敏感性 特异性不定 如 低水平的金属酶 7 改良Hodge试验的质量控制 2009年CLSI M100 S19 APPB 124 随患者菌株每天检测 1 改良Hodge试验阳性菌株 肺克ATCCBAA 1705 2 改良Hodge试验阴性菌株 肺克ATCCBAA 1706 六 D Test试验 1 将待检菌按常规药敏纸片K B法操作均匀涂布于M H平板上 2 在M H平上板贴一片红霉素 15ug 片 纸片 在距纸片边缘1 5cm处贴克林霉素 2ug 片 纸片 3 35 孵育18 24h 如克林霉素出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性 D Test试验耐药表型判断 耐药机制红霉素克林霉素基因型 泵出 MS RSMSRA核糖体基因诱导变异 iMls RD Test ermC为主 核糖体基因结构变异 cMLS RR ermA为主 七 其它耐药表型检测 1 MRSA MRC