杆状病毒介绍

杆状病毒 关键词 昆虫病毒 杆状病毒 核型多角体病毒 颗粒体病毒 质型多角体 病毒 杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的 DNA 病毒 病毒粒子呈杆 状 基因组为双链环状 DNA 分子 DNA 以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内 大小在 90 180 Kb 之间 目前杆状病毒作为高效 安全的无公害生物虫剂广泛 应用于害虫防治 杆状病毒只来源于无脊椎动物 虽然已发现 600 多种杆状 病毒 但进行分子生物学研究的不到 20 种 杆状病毒的基因组为单一闭合环状 双链 DNA 分子 大小为 80 160 kb 其基因组可在昆虫细胞核复制和转录 DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内 后者具有较大的柔韧性 可容纳较大片 段的外源 DNA 插入 因此是表达大片段 DNA 的理想载体 其中 用作外源基因 表达载体的杆状病毒 目前仅限于核型多角体病毒 nuclear polyhedrosis virus NPV 该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约 1 5 m 的包 含体病毒 呈多角体形状 核型多角体病毒有两种形式 一种为包含体病毒 occluded virus OV 另一种则为细胞外芽生病毒 budded virus BV 它们在病毒感染中扮演的角色不同 包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式 昆虫往往是食入污染 OV 的食物后引起感染 包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体 即为 29 000 的多角体蛋白 它对病毒的水平感染起以下作用 保护病毒颗粒 在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活 保证病毒颗粒在适当的位置 释放 引起感染 昆虫中肠上皮局部的强碱性环境 pH 10 5 可使病毒颗粒释 放蛋白酶溶解多角体 BV 病毒是个体内细胞间的感染形式 由细胞芽生出 BV 进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染 近几 十年 有关杆状病毒基因结构 功能和表达调节的研究进展迅速 其中研究最 深入的是m xu苜蓿银蚊夜蛾 autogra phacalifornica 多核型多角体病毒 multiple nuclear polyhedro sis virus MNPV 简称 AcMNPV 或 AcNPV 该 病毒是杆状病毒科 Baculoviridae 的原型 是一种大的 带外壳 的双链 DNA 病毒 能感染 30 多种鳞翅目昆虫 被广泛用作基因表达系统载体 其它作为表 达载体的杆状病毒 主要是来自家蚕的 NP bombyx moil BmNP 由于家蚕 幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白 且成本低 显示出良好的应用 前景 本文主要介绍 AcNPV 病毒 BmNPV 在许多方面与其具有共同的特征 AcNPV 的基因表达分为 4 个阶段 立即早期基因表达 早期基因表达 晚期 基因表达和极晚期基因表达 前两个阶段的基因表达早于 DNA 复制 而后两个 阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒 DNA 合成 其中在极晚期基因表达过程 中 有两种高效表达的蛋白 它们是多角体蛋白和 P10 蛋白 多角体蛋白是形 成包含体的主要成分 感染后期在细胞中的积累可高达 30 50 是病毒复 制非必需成分 但对病毒粒子却有保护作用 可使之保持稳定和感染能力另一 类高效表达的极晚期蛋白为 P10 蛋白 也是一类病毒复制非必需成分 可在细 胞中形成纤维状物质 可能与细胞溶解有关 多角体基因和 P10 基因现在都已 被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力 因此这两个基因位点 成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点 1 杆状病毒基因组的结构和功能研究 杆状病毒基因组为双链环状 DNA 分子 DNA 以超螺旋方式被压缩包装在杆 状核衣壳 rod shaped nueleocapsid 内 核衣壳包被脂质蛋白囊膜 envelope 后形成病毒粒子 核衣壳包括衣壳 capsid 蛋白和髓核 COle 其中衣壳蛋白 是杆状病毒粒子的主要结构蛋白 髓核由病毒 DNA 分子和与其密切相关的碱性 蛋白构成 碱性蛋白同 DNA 紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构 目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 AcMNPV b 家蚕核多角体病毒 BmNPV 黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒 OpMNPV 舞毒 蛾多核衣壳核多角体病毒 LdMNPV 甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒 SeMNPV 棉铃虫核型多角体病毒 HaNPV 以及斜纹夜蛾核型多角体病毒 SphMNPV 目前 AcMNPV 基因组的研究最为深入 它是双链超螺旋大分子环状 DNA 其大 小为 90 160kb 约编码 154 个基因 AcMNPV 基因组的基因组织 gene organization 较为复杂 基因组的不同区域具有功能分化 基因的分布 尚无规律可循 但 AcMNPV 基因组含有 8 个同源区 每区含有不等的重复或倒置 重复序列 这些重复序列由位于中间的不完整回文序列及其两侧各约 20bp 的序 列构成 同源区是杆状病毒基因组普通存在的功能域结构 对于基因表达的调 节具有增强作用 同时也是 DNA 复制的原点 杆状病毒中现已鉴定的基因近 70 种 可分为结构蛋白基因和非结构蛋白基 因两大类 结构蛋白基因如 polh P10 gp64 p6 9 gp41 vp39 等基因 非 结构基因中 与 DNA 复制相关的重要基因有 helicase 基因 he1 dnapol lef 1 lef 2 lef 3 ie 1 ie 2 p35 pe 38 等 起表达调节作 用的基因主要有 ie 1 ie 2 lef 类基因 p35 pe38 等 这些代表性基因与 其功能的关系见表 1 2 杆状病毒载体表达系统的特点 AcNPV 病毒用作外源基因的表达载体 通常是通过体内同源重组的方法 用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒 由于多角体基因启动子在感 染后 18 24h 开始转录和翻译 一直持续到 70 h 外源基因置换掉多角体基因 后 并不影响后代病毒的感染与复制 意味着重组病毒不需要辅助病毒的功能 杆状病毒表达系统自从第一次用来表达干扰素以后在许多重组蛋白的表达中 得到广泛应用 例如用于表达白介素 IL 一 2 3 BMP 及多种病毒蛋白等 相 对其他表达系统它具有以下几个方面的特点 组蛋白具有完整的生物学功能 杆状病毒表达系统可为高表达 的 外源蛋白在细胞内进行正确折叠 二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的 环境 可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白 能进行翻译后的加工修饰 杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整 的翻译后加工能力 包括糖基化 磷酸化 酰基化 信号肽切除及肽段的切 割和分解等 修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致 对比实验证 明 在昆虫细胞发生的糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致 但修饰的寡 糖种类却不完全一样 这种不一致对不同目的蛋白的活性影响不同 所以昆 虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模 型 表达水平高 与其它真核表达系统相比较 此系统最突出的特点 就是能获得重组蛋白高水平的表达 最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白 的 50 能容纳大分子的插入片段 杆状病毒毒粒可以扩大 并能包 装大的基因片段 但目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因长度的上限 能同时表达多个基因 杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时 表达多个基因的能力 既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式 也可 在同一转移载体上同时克隆两个外源基因 表达产物可加工形成具有活性的 异源二聚体或多聚体 另外 昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能 能表 达基因组 DNA 还有对重组蛋白进行定位的功能 如将核蛋白转送到细胞核 上 膜蛋白则定位在膜上 分泌蛋白则可分泌到细胞外等 最后 杆状病毒 对脊椎动物无感染性 现有研究也表明其启动子在 N 动物细胞中没有 活性 因此在表达癌基因或有潜在毒性的蛋白时可能优于其它系统 3 杆状病毒载体的重组与筛选 杆状病毒由于基因组庞大 外源基因的克隆不能通过酶切连接的方式直接 插入 必须通过转移载体的介导 即将极晚期基因 如多角体基因及其边界区 克隆入细菌的质粒中 消除其编码区和不合适的酶切位点 保留其 5 端对高 效表达必需的调控区 并在其下游引入合适的酶切位点供外源基因的插入 即 得到转移载体 将要表达的外源基因插入其启动子下游 再与野生型 AcNPV DNA 共转染昆虫细胞 通过两侧同源边界区在体内发生同源重组 使多 角体蛋白基因被外源基因取代 而将外源基因整合到病毒基因组的相应位置 由于多角体基因被破坏 则不能形成多角体 这种表型在进行常规空斑测定时 可同野生型具有多角体的病毒空斑区别开来 这就是最初的筛选重组病毒的方 式 但由于重组效率较低 0 1 1 表型差别不显著 应用上有一定的困难 为此 经过不断探索 在重组杆状病毒的筛选与鉴定方面取得了很大改进 具 体方法有以下几种 1 半乳糖苷酶的蓝白筛选 2 体外酶促定位重组 3Bacmid 4 TK 基因 5 Neo 基因 3 1 半乳糖苷酶的蓝白筛选 1990 年 Vialard 等在多角体基因的上游 利用 pl0 基因启动子带动 LacZ 基因 构建了转移载体 pJVNheI 将其共转染 sf 细胞后 重组病毒可表达 B 半乳糖苷 酶 通过加入 x gal 使之形成蓝色空斑 便可进行重组病毒的筛选 1990 年 Kins 提出了线形化技术 其原理是线形化的杆状病毒基因组感染性很低 但仍 具有与引入细胞内的同源序列进行同源重组的能力 如果同源序列位于线形化 杆状病毒的两端 则基因组即可环化恢复完整的感染性 使阳性重组率大大提 高 蓝白斑筛选 蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法 野生型大肠杆菌产生的 半乳糖苷酶可以将无色化合物 X gal 5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 切割成半乳糖和深蓝色的物质 5 溴 4 靛蓝 有色物质 可以使整个培养菌落产生颜色变化 而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的 方法 设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为 半乳糖苷酶缺陷型菌株 这种宿 主菌的染色体基因组中编码 半乳糖苷酶的基因突变 造成其编码的 半乳 糖苷酶失去正常 N 段一个 146 个氨基酸的短肽 即 肽链 从而不具有生物 活性 即无法作用于 X gal 产生蓝色物质 用于蓝白斑筛选的载体具有一段称 为 lacz 的基因 lacz 中包括 一段 半乳糖苷酶的启动子 编码 肽链的 区段 一个多克隆位点 MCS MCS 位于编码 肽链的区段中 是外源 DNA 的 选择性插入位点 但其本身不影响载体编码 肽链的功能活性 虽然上述缺陷 株基因组无法单独编码有活性的 半乳糖苷酶 但当菌体中含有带 lacz 的质 粒后 质粒 lacz 基因编码的 肽链和菌株基因组表达的 端缺陷的 半乳 糖苷酶突变体互补 具有与完整 半乳糖苷酶相同的作用 X gal 生成蓝色物 质的能力 这种现象即 互补 操作中 添加 IPTG 异丙基硫代 半乳糖苷 以激活 lacz 中的 半乳 糖苷酶的启动子 在含有 X gal 的固体平板培养基中菌落呈现蓝色 以上是携 带空载体的菌株产生的表型 当外源 DNA 即目的片段 与含 lacz 的载体连接 时 会插入进 MCS 使 肽链读码框破坏 这种重组质粒不再表达 肽链 将它导入宿主缺陷菌株则无 互补作用 不产生活性 半乳糖苷酶 即不可 分解培养基中的 X gal 产生蓝色 培养表型即呈现白色菌落 实验中 通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的 含 X gal 的平板培养基中 同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素 这样 一次筛选可以判 断出 未转化的菌不具有抗性 不生长 转化了空载体 即未重组质粒的菌 长成蓝色菌落 转化了重组质粒的菌 即目的重组菌 长成白色菌落 3 2 体外酶促定位重组 Cre Loxp 系统最早由 Sternberg 等最早建立 噬菌体 Pl 含有 1 个重组位点 Lox 1ocus of rossover 和 1 个 Cre 酶基因 其产物 Cre 酶 为重组所必需 Cre 酶已被克隆纯化 Lox 序列已被测定由 34 个核苷酸组成 其两端为 13 bp 的反转重复序列 中间为 8 bp 的非回文序列 将此序列引入 AcNPV 基因组即得 vAclox 转移载体引入 lox 后可获得 plox vAclox 和 plox 在 Cre 酶存在条件下 两者即可发生体外定点重组 而将载体 上的相应序列转到病毒的基因组中 这是 1 个可逆酶促反应 将反应混合物转 染草地夜蛾 spodoptera frugiperda sf 细胞中 即可得到高比例的重组子代 病毒 这个方法的特点是体外重组 通过控制反应的条件可达到很高的重组率 但由于重组是位点特异性的 反应产物往往是转移载体多次插入亲代病毒的结 果 因而要进行多轮空斑实验纯化病毒 3 3 Bacmid 后来 Luckow 等又发明了一种新的杆状病毒重组技术 他们根据 F 因子载体 原理 用类似于酵母体内重组的方法 构建了一种新杆状病毒穿梭载体 Bacmid 该载体可像质粒一样在大肠杆菌中生长 又对鳞翅目昆虫细胞具有感 染性 Bacmid 含有 F 因子复制子 可在大肠杆菌中复制 卡那霉素抗性基因及 Tn7 转座位点 attTn7 转移载体中 外源基因置于杆状病毒启动子之下 两端 分别为 Tn7 的左右端 以其转化含 Bacmid 的 E coli 菌株 由辅助质粒提供反 式作用发生转座 而将外源基 因转到 Bacmid 的 attTn7 位置 这种重组了外 源基因的 Bacmid 转染的昆虫细胞 可得到 100 阳性重组病毒 这种方法都 是在大肠杆菌中进行的 非常简便 由于没有本底干扰 同样不需进行空斑纯 化 缺点是 F 因子提取不很方便 其稳定性也有待于观察 英文全称 Baculovirus plasmid 中文解释 杆状病毒质粒 带有杆状病毒 基因组的质粒 可在细菌和昆虫细胞之间穿梭 Baculovirus plasmid 简易提取方法 挑白斑摇菌 8h 左右 一般会过夜摇 取 2ml 菌液 12000rpm 30s 弃 上清即可 1 溶液 I 溶菌液 加 300ul 将离心完的菌液混匀 溶菌酶 它是糖苷水解酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 1 4 糖苷键 因而具有溶菌的作用 当溶液中 pH 小于 8 时 溶菌酶作用受 到抑制 葡萄糖 增加溶液的粘度 维持渗透压 防止 DNA 受机械剪切力作用而降 解 EDTA 1 螯合 Mg2 Ca2 等金属离子 抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降 解作用 DNase 作用时需要一定的金属离子作辅基 2 EDTA 的存在 有利 于溶菌酶的作用 因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境 2 溶液 II NaOH SDS 液 加 300ul 裂解 5min 轻柔混匀 最好不要拿 枪吹 上下颠倒混匀就行 NaOH 核酸在 pH 大于 5 小于 9 的溶液中 是稳 定的 但当 pH 12 或 pH 3 时 就会引起双链之间氢键的解离而变性 在溶液 II 中的 NaOH 浓度为 0 2mo1 L 加抽提液时 该系统的 pH 就高达 12 6 因而 促使染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性 SDS 2 SDS 是离子型表面活性剂 它主要功能有 1 溶解细胞膜上 的脂质与蛋白 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜 2 解聚细胞中的核蛋白 3 SDS 能与蛋白质结合成为 R O SO3 R 蛋白质的复合物 使蛋白质变性 而沉淀下来 但是 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用 所以在以后的提取过程中 必须把它去除干净 防止在下一步操作中 用 RNase 去除 RNA 时 受到干扰 3 溶液 III 3mol L NaAc pH4 8 溶液 主要是沉淀蛋白的 加后轻柔 混匀 冰上放置 15min NaAc 的水溶液呈碱性 为了调节 pH 至 4 8 必须 加入大量的冰醋酸 所以该溶液实际上是 NaAc HAc 的缓冲液 用 pH4 8 的 NaAc 溶液是为了把 pH12 6 的抽提液 调回 pH 至中性 使变性的质粒 DNA 能够 复性 并能稳定存在 而高盐的 3mol L NaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA RNA 以及 SDS 蛋白复合物凝聚而沉淀之 前者是因为中和核酸上的电荷 减少相斥力而互相聚合 后者是因为钠盐与 SDS 蛋白复合物作用后 能形成 较小的钠盐形式复合物 使沉淀更完全 4 将冰上放置的混合液 12000rpm 10min 离心 取上清加异丙醇 1 1 然后冰上放 20min 左右 再 12000rpm 离心 10min 5 弃上清 加预冷的 75 乙醇 1ml 洗一下 加完后应该能看到在 EP 管底部 有一小块白色的沉淀 6 然后弃乙醇 留下白色沉淀 如果沉淀飘起 可以再 12000rpm 离心 凉干 加 50ul 左右 TE 或双蒸水 溶解片刻即可 一般情况下应该有 80 100ng ul 3 4 TK 基因 胸苷激酶可将核苷类似物转变成的有毒的中间体而抑制病毒的复制 该核 苷类似物作为疱疹病毒编码胸苷激酶 HSV TK 的底物 能特异性地抑制单纯疱 疹病毒 巨细胞病毒和 EB 病毒的复制 由于这些类似物对病毒的胸苷激酶有高 度的选择性 而细胞自身胸苷激酶对这些类似物的结合常数很低 故能选择性 地杀死表达 HSV TK 基因的细胞 Loss of the tk gene TK 基因缺失 TK 基因编码区大片段缺失 tk 基因 包括 HSV tk VZV tk 编码胸苷激 酶 TK 病毒的 TK 除可以催化脱氧胸苷变成脱氧胸普酸 还可以催化一些核 苷类似物磷酸化 这些磷酸化后的核苷类似物对哺乳细胞有根强毒性 近年 许多学者用多种载体将病毒止基因转入肿瘤细胞 配合核苷类似物作为前药治 疗肿瘤 动物实验效果肯定 现正进入临床研究 3 5 Neo 基因 Neo 抗新霉素的抗药基因 一般用来作为基因表达载体的筛选 表达目的基因的 载体同时带有该基因 这样在培养液加入新霉素 没有被转染的细胞没有抗药性 就不能存活 Neo 是经典的显性选择标记 这是一种细菌编码的磷酸转移酶基因 可使氨基 糖苷类抗生素 G418 失活 后者又是一种蛋白质合成抑制剂 可干扰真核细胞 80S 功能 Neo 曾被引入几种脊椎动物病毒 如痘苗病毒和 EB 病毒 的基因组中 作为选择标记 1989 年 Jarls 将 Neo 引入 sf 细胞染色体中而得到 G418 抗性 的细胞系 说明 Neo 可作为选择标记用于重组病毒的筛选 本方法和 TK 基因相 比较略显繁琐 需经连续传代 但其不用改造辅助病毒 只需在转移载体中引 入 Neo 基因即可 其它如 PCR DNA 斑点杂交及有限稀释法等 也可用于筛选 重组病毒 以上方法各具特点 虽然有些新方法需一定的条件 但一旦建立起来后就可方 便 迅速地得到重组病毒 为杆状病毒表达系统的普及应用创造了良好的条件 4 影响外源蛋白表达的因素 病毒稳定性 细胞表达与幼虫表达 启动子类型 外源基因序列特点 基因的表达与调控 利用杆状病毒昆虫表达系统表达外源基因的理论基础 就是杆状病毒的基因表 达与调控 但有关病毒晚期基因高表达和其调控机制目前还不十分清楚 利用 多角体基因的启动子表达外源基因 影响表达水平的因素除与病毒本身的因素 有关外 还与受感染细胞的种类和生理状况乃至培养基的质量有关 4 1 病毒的稳定性 杆状病毒在细胞中多次传代后 可能引起基因组的 变化 最明显的变化就是形成 ov 的能力降低 由于细胞间不需要 ov 形成感染 只需通过 BV 病毒感染即可 多次传代的病毒也可能出现少多角体 few polyhedfin FP 表型的变化 一般每个感染细胞只含有 10 个多角体病毒 其 中突变病毒多角体的表达水平也有所降低 应用这种突变病毒会对外源基因的 表达带来不利 若重组前病毒是变异 FP 通过肉眼分辨重组与非重组病毒时 有可能发生假象 另外 长期多次传代的病毒也往往引起表达水平的降低 为 避免上述情况的发生 要限制病毒的传代次数 一般控制在 2 3 代以内 4 2 在昆虫细胞内表达与幼虫体内表达 虽然目前大部分工作是在细胞 培养条件下进行的 当需要大量制备某类表达产物时 最好采用昆虫蛹 因为 培养昆虫幼虫远比培养细胞简单 便宜 而且在昆虫体内培养可以提高表达量 一般在幼虫体内的淋巴液中 蛋白含量较在细胞培养基中高 l0 倍以上 例如小 鼠 IL 3 的表达量在淋巴液中较在细胞培养上清中高 500 倍 可能是细胞培养基 中含有的蛋白酶使之降解所致 4 3 启动子类型 在构建转移载体时 使用不同的启动子就需构建相应 的同源序列 目前最常用的启动子有晚期 Polh polyhedrin 启动子和 P10 启动 子 还有碱性启动子以及少数早期启动子 同一目的基因在不同启动子控制下 表达水平会有很大差异 研究发现 分泌类蛋白使用 PIO 启动子或碱性启动子 的效果更好 4 4 外源基因序列的本身因素 能在重组杆状病毒有效表达的外源基 因 5 端及 3 端非编码区越短越好 一般长度在 3 400 个核苷酸以内 影响表达的其他因素包括 密码子的使用情况 是否为昆虫细胞所常用 mRNA 的稳定性及蛋白质的稳定性等 外源基因附近的序列很重要 Kozak 分析了数 百个真核序列 得出两点结论 首先 启动子下游第 1 个 ATG 常作为起始密码 子 其次是在 ATG 附近的序列并不是随机的 有 95 表达的真核基因在 ATG 前 3 位是嘌呤 而且常是 A 4 位是 G 如果 3 的 A 或 4 的 G 有 1 个被嘧啶替代 翻译水平就下降 5 l0 倍 如果 3 位和 4 位均被嘧啶所替代 翻译水平就下降 20 倍 因此 Kozak 提出 GCC GGC A GCC AUG G 是高等真核基因起始密码 附近的保守序列 其中 3 处 A 最为保守 4 5 重组病毒基因的表达与调控 多角体启动子控制的外源基因的表达 紧靠上游的序列对基因的转录调节是最 重要的 许多研究表明 当外源基因 5 端加有 1 58 个多角体蛋白的氨基酸序 列以融合蛋白形式表达时 效果最好 用高 中与低 3 种表达的外源基因进行 实验的结果表明 保留一部分多角体 5 端序列与外源基因以相同的框架相融 合 表达水平最高 如果框架不同 那么从距启动子最近的起始码开始翻译 表达产物水平相对偏低 5 昆虫杆状病毒系统表达外源基因的新进展 1 杆状病毒载体及其表达系统进展 昆虫杆状病毒表达系统进行外源基因表达时 存在的一个问题是筛选带有外源 基因的重组病毒的效率较低 最初仅 0 1 1 而且产物较难纯化 为此 人们设计了各种方法来改进病毒载体 如 NPV DNA 线性化 体外定点酶促重组 以及酵母 昆虫细胞和大肠杆菌 昆虫细胞的穿梭载体的开发等 其中 Posse 等 设计的重组 救活可线性 AcNPV 病毒载体 BacPAK6 的重组效率较高 高达 80 以上 具有重要的应用价值 该重组技术的基本原理为 先找一个在 AcMNPV 基因组中不存在的 Bsu36 I 酶 切位点 采用体外突变 在多角体基因两侧的非必需基因 ORF603 基因和必需基 因 ORF1629 基因中各引入一个 Bsu36 I 位点 然后通过重组将突变了的由 ORF603 基因 多角体基因启动子控制的半乳糖苷酶基因 ORF1629 基因引入 AcNPV 基因组 获得重组病毒载体 BacPAK6 BacPAK6 DNA 经 Bsu36 I 酶切而 破坏了必需基因 OBF1629 因而靠自身环化不能成活 必须与携带多角体蛋白 基因启动子控制的外源基因和 OBF1629 基因的转移载体发生重组 病毒才能复 制而救活 因此 该法的重组率很高 这一系统现已扩展到了 BmNPV 表达系统 易咏竹等副通过克隆的家蚕核多角体病毒解螺旋基因 DNA 与重组救活可线性 化的苜蓿尺蠖 核多角体 病毒基 因工 程载体 病毒 BacPAK6 DNA 在昆虫细胞 中发生重组 经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞 Sf 21 的宿 主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 HyBacPAK6 它与含植酸酶基因的转移载体 Pvl1393phy 在家蚕细胞中的重组率达 90 以上 此外 Bac to Bac 表达系统是效率很高的表达系统 它利用穿梭质粒 bacmid 在大肠杆菌 中高效复制后 再提纯用于转染昆虫细胞 大大缩短了时间 王汉 中等根据 BactoBac 表达系统的基本原理 也构建了一种新颖的棉铃虫单粒包埋 核多角体病毒表达系统 HaBac to Bac 该系统中供体质粒 pFastPhP10 中插 入了带有多角体启动子序列的完整的多角体蛋白基因 因而多角体蛋白基因的 表达和包涵体的形成也可作为转染成功的重要识别标记等 这是商品化的 AcBac to Bac 系统所不具备的 4 5 6 目前可被应用于昆虫杆状病毒表达系统的细胞系较多 但应用较多的细胞 系是秋粘虫 s frugiperda 卵巢组织的细胞系 sf 9 以及家蚕细胞系 洪华珠 等建立了一株高水平表达重组蛋白的昆虫细胞系 HNU Tn FB1 它是粉纹夜蛾 Trichoplusia ni 脂肪体的传代细胞系 在辅以 5 胎牛血清的商品无血清培 养基 Excell400 中 该细胞群体的倍增时间为 22 9h 最高密度可达 2 2 106 ml 表达由 AcMNPV 构建的重组 p 半乳糖苷酶的水平达 225 5 13 4 IU ml 该细胞系在表达重组蛋白方面与目前商业上最好的 高 五 细胞 BTI Tn 5B1 4 相当 是一株很有价值的细胞系 具有广阔的应用 前景 另外 一些影响杆状病毒系统表达外源基因产物的因素在近两年得到了研究 杆状病毒吸附宿主细胞的动力学参数是影响细胞感染效果和表达物产量的因素 之一 Petricevich 等 以表达轮状病毒的重组蛋白 VP4 为例 对病毒吸附动力学的参 数进行了研究 发现影响细胞感染效果的主要参数是胎牛血清浓度 不用胎牛 血清或经高温处理后再使用 反而可以获得更高浓度的表达产物 重组病毒感染 sf 9 的效果与细胞周期有关 Saito 等对 GFPuv 基因在杆状病毒 系统中表达的研究表明 当在宿主细胞的 G 期感染时 细胞内的荧光强度是在 G2 M 期感染的 1 3 倍 同时在宿主细胞的 G S 期感染时 感染量是在 G M 期感染的 1 5 1 8 倍 该研究结果对于选择病毒感染宿主细胞的时期 有一定的借鉴意义 01ejnik 等讨论了高渗透压对昆虫细胞表达重组蛋白产量的影响 采用补料分 批培养发现 Trichoplusia ni BTI TN 5B1 4 Tn 5 细胞具有很强的耐高渗透 压能力 表达的重组核蛋白产量比等渗环境下的高出 72 该结果对于提高重 组蛋白的产量具有重要意义 可能的原因是高渗透压下 葡萄糖的比耗率增加 细胞内重组蛋白的合成代谢更加旺盛 另外 杆状病毒易被紫外线钝化 Dustin 等 将海藻病毒的嘧啶特殊二聚物糖 基化酶 CV PDG 用杆状病毒 AcMNPV 表达后 发现重组 AcMNPV 受紫外线钝化 的影响比野生型降低了 3 倍 该研究为提高杆状病毒抗紫外线能力提供了一个 可行的办法 昆虫杆状病毒系统的应用展望 1 对外源基因克隆容量大 2 重组病毒易于筛选 3 具有完备的翻译后加工修饰系统 4 高效表达外源基因的能力 杆状病毒表达系统由于对外源基因克隆容量大 重组病毒易于筛选 具有 完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的