色谱分析实验大纲

气相色谱法分析苯 甲苯 萘混合物气相色谱法分析苯 甲苯 萘混合物 一 实验目的 1 气相色谱图的分析 2 温度对保留时间的影响 3 保留因子 分离度的计算 4 标准曲线的建立 二 实验原理 基本术语 基线 base line 经流动相冲洗 柱与流动相达到平衡后 检测器测出一段时间的流出曲线 一般应平行于时间轴 噪音 noise 基线信号的波动 通常因电源接触不良或瞬时过载 检测器不稳定 流动相含 有气泡或色谱柱被污染所致 漂移 drift 基线随时间的缓缓变化 主要由于操作条件如电压 温度 流动相及流量的不 稳定所引起 柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移 色谱峰 peak 组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线上的突起部分 正常色谱峰近 似于对称形正态分布曲线 高斯 Gauss 曲线 峰高 peak height h 峰的最高点至峰底的距离 峰宽 peak width W 峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离 半峰宽 peak width at half height Wh 2 峰高一半处的峰宽 峰面积 peak area A 峰与峰底所包围的面积 死时间 dead time t0 不保留组分的保留时间 即流动相 溶剂 通过色谱柱的时间 保留时间 retention time tR 从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间 保留因子 分离度 气相色谱中随着温度升高 目标物保留时间减少 分离度降低 三 仪器与试剂 仪器 高效液相色谱仪 超声波清洗器 色谱柱 C18 微量注射器 20ul 试剂 甲醇 A R 苯 A R 甲苯 A R 萘 A R 四 实验步骤 1 色谱条件为 气相色谱柱 流动相 氮气 进样量 10 0ul 进样口 150 oC 柱温箱 80 oC 检测器 250 oC 2 溶液配制 1 储备溶液配制 准确称取苯 2 000g 甲苯 2 000g 萘 2 000g 分别置于 3 个 100mL 容 量瓶中 用甲醇溶解后 定容至刻度 2 标准溶液配制 根据实验需要 准确吸取一定量的储备液 分别配制成苯 0 04 1 0 mg mL 甲苯 0 04 1 0 mg mL 萘 0 04 1 0 mg mL 标准溶液 3 基线走稳后 分别注入苯 甲苯 萘的标准溶液 10 0uL 记录各物质的色谱峰 记下各 组分的死时间 保留时间 峰宽和峰面积 4 注入待测样品溶液 10 0uL 记下各组分的死时间 保留时间 峰宽和峰面积 5 实验完毕 按要求关好仪器 五 思考题 1 气相色谱中温度对保留时间的影响及原因 2 计算保留时间 分离度和理论塔板高度 3 建立标准曲线 液相色谱法分析苯 甲苯 萘混合物液相色谱法分析苯 甲苯 萘混合物 一 实验目的 1 气相色谱图的分析 2 流动相对保留时间的影响 3 保留因子 分离度的计算 4 标准曲线的建立 二 实验原理 基本术语 基线 base line 经流动相冲洗 柱与流动相达到平衡后 检测器测出一段时间的流出曲线 一般应平行于时间轴 噪音 noise 基线信号的波动 通常因电源接触不良或瞬时过载 检测器不稳定 流动相含 有气泡或色谱柱被污染所致 漂移 drift 基线随时间的缓缓变化 主要由于操作条件如电压 温度 流动相及流量的不 稳定所引起 柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移 色谱峰 peak 组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线上的突起部分 正常色谱峰近 似于对称形正态分布曲线 高斯 Gauss 曲线 峰高 peak height h 峰的最高点至峰底的距离 峰宽 peak width W 峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离 半峰宽 peak width at half height Wh 2 峰高一半处的峰宽 峰面积 peak area A 峰与峰底所包围的面积 死时间 dead time t0 不保留组分的保留时间 即流动相 溶剂 通过色谱柱的时间 保留时间 retention time tR 从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间 保留因子 分离度 工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线 求出斜率 截 距 在完全相同的条件下 准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液 根据待测组分的 信号 从标准曲线上查出其浓度 反相液相色谱中随着有机相浓度增加 目标物保留时间减少 分离度降低 三 仪器与试剂 仪器 高效液相色谱仪 超声波清洗器 色谱柱 C18 微量注射器 20ul 试剂 甲醇 A R 苯 A R 甲苯 A R 萘 A R 四 实验步骤 1 色谱条件为 色谱柱 C18 4 6mm 150 0mm 流动相 甲醇 水 70 30 80 20 90 10 超声半小时脱气 进样量 10 0ul 检测器 UV 波长 254nm 灵敏度 0 02 0 2AUFS 2 溶液配制 1 储备溶液配制 准确称取苯 2 000g 甲苯 2 000g 萘 2 000g 分别置于 3 个 100mL 容 量瓶中 用甲醇溶解后 定容至刻度 2 标准溶液配制 根据实验需要 准确吸取一定量的储备液 分别配制成苯 0 04 1 0 mg mL 甲苯 0 04 1 0 mg mL 萘 0 04 1 0 mg mL 标准溶液 3 基线走稳后 分别注入苯 甲苯 萘的标准溶液 10 0uL 记录各物质的色谱峰 记下各 组分的死时间 保留时间 峰宽和峰面积 4 注入待测样品溶液 10 0uL 记下各组分的死时间 保留时间 峰宽和峰面积 5 实验完毕 按要求关好仪器 五 思考题 1 反相高效液相色谱中流动相组分对保留时间的影响及原因 2 如何建立标准曲线 高效液相色谱分析茶叶中的生物碱高效液相色谱分析茶叶中的生物碱 一 实验目的 1 茶叶中生物碱的提取 2 茶叶中生物碱含量的测定 二 实验原理 溶解性 咖啡因 乙酸乙酯 氯仿 嘧啶 吡咯 四氢呋喃中可溶 酒精和丙酮中一般可溶 石油 醚 醚及苯中微溶 茶碱 常温下溶于水 乙醇 氯仿 氢氧化碱液 氨水 稀盐酸和稀硝酸中 微溶于乙醚 可可碱 微溶于水 乙醇 中度溶于胺 蛋白质的胶体性质 蛋白质分子颗粒大小在 1 100nm 胶体范围之内 维持蛋白质溶液稳定 的因素有两个 1 水化膜 蛋白质颗粒表面大多为亲水基团 可吸引水分子 使颗粒表面形成一层水化 膜 从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集 防止溶液中蛋白质的沉淀析出 2 同种电荷 在 pH pI 的溶液中 蛋白质带有同种电荷 pH pI 蛋白质带负电荷 pH pI 蛋白质带正电荷 同种电荷相互排斥 阻止蛋白质颗粒相互聚集 发生沉淀 蛋白质沉淀法有 1 热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定 PH 值下易变性的杂蛋 白 2 有机溶剂沉淀法多用于生物小分子 多糖及核酸产品的分离纯化 有时也用于蛋白质沉 淀 有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数 导致具有表面水层的生物大分子脱水 相 互聚集 最后析出 该法优点在于 1 分辨能力比盐析法高 即蛋白质或其它溶剂只在一 个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀 2 沉淀不用脱盐 过滤较为容易 3 在生化制备中应 用比盐析法广泛 其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活 操作要求在低温 下进行 总体来说 蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍 3 等电点沉淀法用于氨基酸 蛋白质及其它两性物质的沉淀 但此法单独应用较少 多与 其它方法结合使用 4 非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子 5 生成盐复合物沉淀用于多种化合物 特别是小分子物质的沉淀 6 盐析法 三 仪器与试剂 仪器 高效液相色谱仪 超声波清洗器 加热磁力搅拌 色谱柱 C18 微量注射器 20ul 试剂 甲醇 HPLC 乙醇 A R 乙腈 A R 咖啡因 A R 茶碱 A R 可可碱 A R 茶叶 四 实验步骤 1 色谱条件为 色谱柱 C18 4 6mm 150 0mm 流动相 甲醇 水 30 70 超声半小时脱气 进样量 10 0ul 检测器 UV 波长 254nm 灵敏度 0 02 0 2AUFS 2 茶叶中生物碱的提取 将 10 0g 粉碎后的茶叶粉末置于 100 0 mL 50 乙醇的烧瓶中加热 至 70 0 oC 萃取 30 0 分钟 沉淀 过滤后得到的滤液 1 1 加入乙腈沉淀蛋白质 用 0 45um 水相滤膜过滤 3 溶液配制 1 储备溶液配制 准确称取咖啡因 1 0mg 茶碱 1 0mg 可可碱 1 0mg 分别置于 3 个 4 0 mL 样品瓶中 用甲醇溶解 2 标准溶液配制 根据实验需要 准确吸取一定量的储备液 分别配制成咖啡因 0 01 0 5 mg mL 茶碱 0 01 0 5 mg mL 可可碱 0 01 0 5 mg mL 标准溶液 4 基线走稳后 分别注入咖啡因 茶碱 可可碱的标准溶液 10 0uL 记录各物质的色谱峰 记下各组分的保留时间和峰面积 5 注入待测样品溶液 10 0uL 记下各组分的保留时间和峰面积 6 实验完毕 按要求关好仪器 五 思考题 1 天然物中生物碱的提取要注意什么 2 提取时什么条件对提取效果有影响 高效液相色谱分析盐角草中的酚酸高效液相色谱分析盐角草中的酚酸 一 实验目的 1 盐角草中的酚酸的提取 2 盐角草中的酚酸含量的测定 3 液相色谱分析中流动相添加剂的应用 二 实验原理 溶解性 原儿茶酸 溶于水 乙醇 乙醚 咖啡酸 易溶于热水 冷乙醇 阿魏酸 溶于热水 乙醇和乙酸乙酯 流动相添加剂作用原理 1 抑制色谱柱上残留硅醇基的电离 2 控制化合物的电离状态了 酸性化合物加酸时基本能控制在分子状态 而碱性化合物 的分离在酸性条件下也只有一种电离状态了 如果不加酸 对某些 PKa 在中性左右的离子 型化合物会出现裂峰的现象的 一个化合物出两个峰 分析酸性化合物加酸起到改善峰型 改善分离度 防止拖尾的效果 三 仪器与试剂 仪器 高效液相色谱仪 超声波清洗器 加热磁力搅拌 色谱柱 C18 微量注射器 20ul 试剂 乙腈 HPLC 原儿茶酸 A R 咖啡酸 A R 阿魏酸 A R 盐角草 四 实验步骤 1 色谱条件为 色谱柱 C18 4 6mm 150 0mm 流动相 乙腈 水 三氟乙酸 20 80 0 1 超声半小时脱气 进样量 10 0ul 检测器 UV 波长 270nm 灵敏度 0 02 0 2AUFS 2 盐角草中酚酸的提取 将 1 0g 粉碎后的盐角草粉末置于 20 0 mL 去离子水中加热至 80 0 oC 萃取 30 0 分钟 沉淀 过滤后得到的滤液 1 1 加入乙腈沉淀蛋白质 用 0 45um 水相滤 膜过滤 3 溶液配制 1 储备溶液配制 准确称取原儿茶酸 1 0mg 咖啡酸 1 0mg 阿魏酸 1 0mg 分别置于 3 个 4 0 mL 样品瓶中 用流动相溶解 2 标准溶液配制 根据实验需要 准确吸取一定量的储备液 分别配制成原儿茶酸 0 01 0 5 mg mL 咖啡酸 0 01 0 5 mg mL 阿魏酸 0 01 0 5 mg mL 标准溶液 4 基线走稳后 分别注入原儿茶酸 咖啡酸 阿魏酸的标准溶液 10 0uL 记录各物质的色 谱峰 记下各组分的保留时间和峰面积 5 注入待测样品溶液 10 0uL 记下各组分的保留时间和峰面积 6 实验完毕 按要求关好仪器 五 思考题 1 天然物中生物酸的如何提取 2 液相色谱流动相中酸或碱添加剂的使用要注意什么 手性配体交换色谱法直接拆分氧氟沙星对映体手性配体交换色谱法直接拆分氧氟沙星对映体 一 实验目的 1 了解手性配体交换色谱法 2 流动相中盐类添加剂的应用 二 实验原理 在手性固定相拆分法中 DL 氨基酸通过配体交换与固定配体形成一对非对映的络合物 二 者的热力学稳定性差异导致了氧氟沙星对映体的拆分 图图 1 手性配体交换色谱手性分离原理 三 仪器与试剂 仪器 高效液相色谱仪 超声波清洗器 加热磁力搅拌 色谱柱 C18 微量注射器 20ul 试剂 甲醇 HPLC 氧氟沙星 A R 左氧氟沙星 A R 氨基酸 A R 四 实验步骤 1 色谱条件为 色谱柱 C18 4 6mm 150 0mm 流动相 甲醇 水 亮氨基酸 硫酸铜 88 12 10 mmol L 5 mmol L 超声半小时脱气 进样量 10 0ul 检测器 UV 波长 293nm 灵敏度 0 02