微生物的计数——血球计数板法

微生物的计数微生物的计数 血球计数板法血球计数板法 摘要摘要 测定微生物细胞数量的方法很多 有分光光度法 显微直接计数法 和平板计数法 分光光度法比较简便 易操作 但是会使数据严重偏大 而平 板计数法则会使实验数据严重偏小 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液 如有杂菌或杂质 常不易分辨 菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板 一般细菌则采 用彼得罗夫 霍泽 Petrof Hausser 细菌计数板 两种计数板的原理和部件 相同 只是细菌计数板较薄 可以使用油镜观察 而血球计数板较厚 不能使 用油镜 计数板下部的细菌不易看清 本实验采用血球计数板法 主要目的是 了解血球计数板法的构造和使用方法 学会用血球计数板对酵母菌细胞进行计 数 一 实验目的与要求一 实验目的与要求 1 了解微生物计数常用的三种方法 分光光度法 平板计数法 血球计 数板法 2 了解血球计数板的构造和使用方法 3 学会用血球计数板对酵母细胞进行计数 二 基本原理二 基本原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数 是一种常用的微生物计数方法 此 法的优点是直观 快速 将经过适当稀释的菌悬液 或孢子悬液 放在血球计 数板载玻片与盖玻片之间的计数室中 在显微镜下进行计数 由于计数室的容 积是一定的 0 1mm2 所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成 单位体积内的微生物总数目 由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和 故又 称为总菌计数法 血球计数板 通常是一块特制的载玻片 其上由四条槽构成三个平台 中 间的平台又被一短横槽隔成两半 每一边的平台上各刻有一个方格网 每个方 格网共分九个大方格 中间的大方格即为计数室 微生物的计数就在计数室中 进行 计数室的刻度一般有两种规格 一种是一个大方格分成 16 个中方格 而每 个中方格又分成 25 个小方格 另一种是一个大方格分成 25 个中方格 而每个 中方格又分成 16 个小方格 但无论是哪种规格的计数板 每一个大方格中的小 方格数都是相同的 即 16 25 400 小方格 每一个大方格边长为 1mm 则每一大方格的面积为 1mm2 盖上盖玻片后 载玻片与盖玻片之间的高度为 0 1mm 所以计数室的容积为 0 1mm3 在计数时 通常数五个中方格的总菌数 然后求得每个中方格的平均值 再乘上 16 或 25 就得出一个大方格中的总菌数 然后再换算成 1ml 菌液中的 总菌数 下面以一个大方格有 25 个中方格的计数板为例进行计算 设五个中方格中 总菌数为 A 菌液稀释倍数为 B 那么 一个大方格中的总菌数 因 1ml 1cm3 1000mm3 50000A B 个 同理 如果是 16 个中方格的计数板 设五个中方格的总菌数为 A 则 三 实验材料三 实验材料 1 菌种 酿酒酵母菌 2 用品 显微镜 血球计数板 酒精灯 盖玻片 接种环 番红染液 胶 头滴管 四 实验方法四 实验方法 1 实验流程图 2 实验步骤 1 镜检计数室 在加样前 先对计数板的计数室进行镜检 若有污物 则需 清洗后才能进行计数 2 将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释 菌液如不浓 可不必稀释 3 取洁净的血球计数板一块 在计数区上盖上一块盖玻片 然后在显微镜下 找到计数室 若计数室沾有杂质或者菌体 要用蒸馏水冲洗计数板 用滤纸吸 干其上的水分 然后再放到显微镜下找到计数室 4 将酵母菌悬液摇匀 用滴管吸取少许 从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖 玻片的下边缘摘入一小滴 不宜过多 让菌悬液利用液体的表面张力充满计数 区 勿使气泡产生 并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液 5 静置片刻 先在低倍镜下找到计数区后 再转换高倍镜观察并计数 由于生 活细胞的折光率和水的折光率相近 观察时应减弱光照的强度 6 计数时若计数区是由 16 个大方格组成 按对角线方位 数左上 左下 右 上 右下的 4 个大方格 即 100 小格 的菌数 如果是 25 个大方格组成的计数 区 除数上述四个大方格外 还需数中央 l 个大方格的菌数 即 80 个小格 如菌体位于大方格的双线上 计数时则数上线不数下线 数左线不数右线 以 减少误差 本实验采用 25 格 16 格的血球计数板 计数时应数 5 个大方格 7 计数 每个样品重复计数 2 3 次 每次数值不应相差过大 否则应重新操 作 求出每一个小格中细胞平均数 N 按公式计算出每 ml g 菌悬液所含 制备稀释液 加样 找计数室 计数 酵母菌细胞数量 8 测数完毕 取下盖玻片 用水将血球计数板冲洗干净 切勿用硬物洗刷或抹 擦 以免损坏网格刻度 洗净后自行晾干或用吹风机吹干 放入盒内保存 9 计算结果 可用以下公式进行计算 1 16 格 25 格的血球计数板计算公式 细胞数 ml 100 小格内细胞个数 100 400 10000 稀释倍数 2 25 格 16 格的血球计数板计算公式 细胞数 ml 80 小格内细胞个数 80 400 10000 稀释倍数 5 5 实验结果实验结果 各大格中细胞数计 算 次 数 左 上 右上 左 下 右下 中 间 大格中 细胞总 数 稀 释 倍 数 总菌数 CFU mL 或 g 第 一 次 3237403944960100960000000 六 结论与分析六 结论与分析 1 误差来源 本次试验中我们组用的是 2 号酵母培养液 是本次试验所用的酵母培养液中浓 度最高的培养液 但是经过老师分析 实验数据仍然偏大的一点 产生这种误 差的原因大概如下 酵母细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差 其中由于操作人 员不注意细节 器材处理 使用不当 稀释不准确 细胞识别错误等因素所造 成的误差属技术误差 而由于仪器 计数板 盖片 吸管等 不够准确与精密 带来的误差称仪器误差 由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于 分布误差或计数域误差 filederror 由于时间的关系 实验计数的次数太少 难以得到准确均匀的实验数据 在实验过程中 操作人员也存在一定的不严谨性 导致实验结果产生误差 由 于没有足够多的平行数据 难以用科学的计数方法进行结果的计算 因此难以 得到比较准确的实验数据 因此 搞好酵母细胞计数的质量控制一般需采用以下措施 1 避免技术误差 纠正仪器误差 所用器材均应清洁干燥 计数板 血盖片 微量吸管及刻度吸管的规格应符 合要求或经过校正 严格操作 从消毒 稀释 加样到计数都应规范 尤其应注意的是样品稀释 要作到充分混匀 必须一次性充满计数室 防止产生气泡 充入细胞悬液的量 以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜 2 缩小计数域误差或分布误差由于血细胞在充入计数室后呈随机分布或 而我 们所能计数的细胞分布范围是有限的 由此造成的计数误差称为计数域误差或 分布误差 缩小这种误差的有效方法就是尽量扩大细胞计数范围和计数数目 一般先进行误差估计 然后决定所需计数的数目和计数范围 只要能将误差控 制在允许范围内即可 2 不足之处 血球计数板在显微镜下直接进行测定 它观察在一定的容积中的微生物的 个体数目 然后推算出含菌数 简便快捷 但是在计数时包括死活细胞均被计 算在内 还有微小杂物也被计算在内 这样得出结果往往偏高 因此适用于对 形态个体较大的菌体或孢子进行计数 7 7 思考题思考题 1 试述血球计数板的计数原理 为什么用两种规格不同的计数板计数同一样品 结果是一样的 答 每块计数板由 H 形凹槽分为 2 个同样的计数池 计数池两侧各有一支持 柱 将特制的专用盖玻片覆盖其上 形成高 0 10mm 的计数池 计数池画有长 宽各 3 0mm 的方格 分为 9 个大方格 每个大格面积为 1 0mm 容积为 0 1mm 中央大方格用双线分成 25 个中方格 位于正中及四角 5