微柱凝胶免疫检测技术博迅产品操作03版

微柱凝胶免疫检测技术,反应原理 微柱凝胶免疫反应的本质是红细胞凝集试验，也可称之微柱凝胶血凝试验（Microcolumn Gel Heamagglutination Assay，MGHA）。 在微柱凝胶管中，红细胞和相应抗体结合后，形成红细胞凝集团块。在一定离心力下，该凝集团块位于胶表面或胶中；而红细胞未和相应抗体结合，仍为分散的红细胞，在同样的离心力下，红细胞沉降到微柱管尖底部。,,4+,2+,-,,特点和优点 简单：不需洗涤，对阴性结果不需确证试验，适用于大量标本检测，解决了Coombs试验因为程序复杂费时等原因未能在临床常规应用问题。 使不完全抗体检测理论“金标准”成为临床的“金标准”。 多份标本一次离心出结果，有利于临床大量标本检测。 另外还具备准确、敏感、标本用量少、结果保存时间长、易于标准化、 操作更安全等优点。,产品操作,一.准备工作检测卡的准备1.在18-25条件下平衡30分钟。2.离心2-3分钟，均衡反应介质。3.外观检查应无气泡、干胶和杂质。4.要缓慢撕膜。防止膜面上的液滴凝结（因冷热交替产生的）污染邻孔。,离心！,,检测标本的准备1.标本要求用EDTA抗凝管采集的新鲜血（如陈旧血需设阴性对照）。2.抗凝血样标本要上清澄清。如有纤毛状、浑浊、乳糜、溶血、脂肪等状，应 再次洗涤离心。为防止纤维蛋白影响红细胞沉降，建议使用红细胞稀释液。3.血辫血样须放置试管中离心处理，确保血清澄清微黄。必要时需洗涤。4.在18-25条件下平衡30分钟，防止冷凝集。红细胞悬液的制备1.将红细胞配制为0.8%的悬液，最高浓度不要超过1% 。如:取8l 压积红细胞，加入到1ml的红细胞稀释液（抗人球蛋白试验要求用低离子液配置红细胞悬液）中，配制出的红细胞悬液浓度大约为0.8%。2.外观检查呈均匀淡红色，无血块、无絮状物（如有纤维蛋白需去除）。,,二.结果判定阳性结果：红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应。阴性结果：红细胞抗原无相应的抗体结合，不出现特异性抗原抗体复合物，红细胞沉于微柱凝胶的尖底部，为阴性反应。反应强度：特异性红细胞抗原抗体复合物位于胶表面，为强阳性反应；复合物在胶中，为弱阳性反应；愈靠近胶底部颗粒愈小，反应愈弱。,？,,4+ 红细胞复合物（凝集）位于凝胶表面3+ 大部分红细胞复合物位于凝胶表面，少部分位于凝胶中部2+ 大部分红细胞复合物位于凝胶中部，少部分位于凝胶中上部1+ 红细胞复合物位于凝胶中下部 与同一卡中阴性管结果对照，如与阴性结果有差别，即为 - 红细胞完全沉积在凝胶管尖底部完全溶血 凝胶和液体无凝集或未凝集的红细胞，液体出现透明清澈红色不完全溶血 残留红细胞在胶表面、胶中或胶底部，液体出现透明清澈红色混合凝集 红细胞复合物位于凝胶表面和凝胶底部, 完全 不完全 混合凝集,现象及说明,反应强度,,三、标准操作规程,,1、ABO、RhD血型定型检测卡（单克隆抗体）操作步骤：1）将准备好的检测卡做好标记；2）将待检者血浆分别加入5-6管中，各50l；,,3）将待检者0.8%红细胞悬液分别加入1-4管中，各50l；,,待检者0.8%红细胞悬液,50l,50l,50l,50l,4）取0.8%的ABO血型反定型红细胞试剂，分别加入5-6管中，各50l；,5）离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）；6）结果判读。,结果：A型RhD阳性,,2、ABO、RhD血型检测卡（微柱凝胶）操作步骤：1）将准备好的检测卡做好标记；2）将待检者0.8%红细胞悬液分别加入第13或46管中，各50l；,待检者的0.8%红细胞悬液,,3）离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）；4）结果判读。,结果：1.A型RhD阳性； 2.B型RhD阳性,,3、Rh血型抗原检测卡（单克隆抗体）操作步骤:1）将准备好的检测卡做好标记；2）将待检者0.8%红细胞悬液分别加入16管中，各50l；,待检者0.8%红细胞悬液,,3）离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）；4）结果判读。,结果：RhD、C、e阳性,,4、抗人球蛋白检测卡不规则抗体筛检 操作步骤：1）将准备好的检测卡做好标记； 2）将0.8%、筛检红细胞各50l分别加入对应的微管中;,,3）将待检者血浆各50l分别加入、微管中；4）37孵育15分钟；,待检者血浆,,50l,50l,50l,5）离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）；6）结果判读。,根据当前使用的筛检红细胞的反应格局来判定,,5、抗人球蛋白检测卡交叉配血试验操作步骤：1）将准备好的检测卡做好标记； 2）将供血者0.8%红细胞悬液与受血者血浆各50l先后加入主侧管中；,受血者血浆,50l,供血者红细胞悬液,50l,,3）将受血者0.8%红细胞悬液与供血者血浆各50l先后加入次侧管中；4）37孵育15分钟；,供血者血浆,50l,受血者红细胞悬液,50l,,5）离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）；6）结果判读。,例如上图：1、3不配合；2配合,,交叉配血实验注意事项1.应用直接抗人球蛋白微柱凝胶免疫试验检测病人红细胞时，一定要用适量EDTA的试管采血液标本，该标本不能放入2-8冰箱保存，以避免红细胞在病人体外致敏所致假阳性反应。2.红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。尽可能应用当日采集的新鲜血做本试验。如不得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本实验。3.血清标本：血清标本必须充分去纤维蛋白，否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍阴性红细胞沉淀，呈假阳性反应。4.如在微柱凝胶管中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论其原因。5.每日试验前，先取出微柱凝胶卡放置至室温。6.红细胞悬液的浓度应为0.8%，不得超过1%。7.使用低离子液（Liss液）稀释红细胞可增强敏感性。8.检测卡应放在18-25储存，如若长期放在4冰箱，建议每1个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。,,操作步骤：1）将准备好的检测卡做好标记； 2）将0.8%待检者和阴性对照（健康男性O型）红细胞悬液各50l分别加入微管中；,1,0.8%待检者红细胞悬液,阴性对照,6、抗人球蛋白检测卡抗人球蛋白试验,,3）离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）；4）结果判读。,结果：1、2、3和5阳性4阴性,,7.抗人球蛋白检测卡母体IgG抗体效价检测 操作步骤 1）在试管中分别加入200l母体血清和200l 2-ME应用液，然后置于37水浴30-60分钟。以充分破坏血清中IgM类抗体；,200l母体血清,200l 2-Me,37水浴30-60分钟,,2）取6只干净试管，分别做好标记。将处理后的血清做倍比稀释；,32,64,128,256,512,16,350l,200l,200l,200l,200l,200l,标记并加入稀释液,32,64,128,256,16,灭活后的血清,50l,200l,200l,200l,200l,200l,512,,3）将准备好的HDN母体IgG抗体效价检测卡做好标记，在所有孔中分别加入50l父亲（或父亲同型）的0.8%红细胞悬液（ABO血型系统IgG血型抗体）或在所有孔中分别加入50l标准O型0.8%红细胞悬液（测定孕妇ABO血型系统以外IgG血型抗体）；,0.8%红细胞悬液,,4）依次将50l倍比稀释血清分别加入对应孔中；,16,32,50l,50l,50l,50l,50l,50l,64,512,256,128,,5）37孵育15分钟；6）离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）；7）结果判读。,结果：效价为 1：128,提示： 将每次采集的血清标本分装冻存，每次检测要以同样的方法、同样的表型抗原红细胞，当次检测的血清要和以前冻存的血清同时对照试验。,,HDN母体IgG抗体效价检测实验注意事项1.血清标本：血清标本必须充分去除纤维蛋白，否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍红细胞沉淀，呈假阳性反应。2.父亲红细胞标本也可用与其同型的A型或B型红细胞代替。3.每日试验前，先取出微柱凝胶卡放置至室温。4.红细胞悬液的浓度应为0.8%，最高不超过1%。5.检测卡应放在18-25储存，如若长期放在4冰箱，建议每1-2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。6.倍比稀释时要注意正确更换枪头。7.灭活时要注意用封口膜密封试管口。,,操作步骤：1）将准备好的检测卡做好标记；2）将0.8待检者红细胞悬液分别加入1-6管中,各50l；,待检者0.8%红细胞悬液,8、新生儿ABO、RhD血型检测卡（微柱凝胶）新生儿溶血病检测卡,,3）离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）；4）结果判读。,结果：AB型RhD阳性， 直抗试验阳性。,,9、抗人球蛋白检测卡-新生儿溶血病胎（婴）儿不完全抗体检测卡准备工作热放散：取同体积的压积血（至少洗涤三次）和牛血清白蛋白混匀，置于56水浴10分钟，期间不断摇动，然后离心分钟（2000rpm），取上清。即放散液。酸放散： a.用生理盐水洗涤待检红细胞4次。b.配制放散液(取4体积的放散液A与1体积的放散液B混合均匀)。c.将待检压积红细胞与酸放散液等体积混合均匀，室温孵育1-2分钟。d.以3000rpm离心1-2分钟。e.立即将酸放散液移到另一只干净试管中，并加入紫红色中和液调至肉色或水粉色（500ul放散液加入中和液80-85ul），此时PH值近中性。f.将中和后的酸放散液再次进行离心（3000rpm离心1-2分钟）取上清即放散夜。,,操作步骤1）将准备好的检测卡做好标记；,2）将0.8A型红细胞悬液各50l分别加入1号、4号管中；将0.8B型红细胞悬液各50l分别加入2号、5号；将0.8的O型红细胞悬液各50l分别加入3号、6号孔中；3）将13管分别加入50l新生儿血浆，46管分别加入50l新生儿红细胞放散液；,0.8%红细胞悬液,,4）37孵育15分钟；5）离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）；6）结果判读。,结果：游离抗体阳性、放散试验阳性,,新生儿溶血病检测实验注意事项1.红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。尽可能应用当日采集的新鲜血做本实验。如不得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本实验。2.血清标本：血清标本必须充分去除纤维蛋白，否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍红细胞沉淀，呈假阳性反应。3.如在微柱凝胶中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员多报告并讨论。4.父亲红细胞标本也可用与其同型的A型或B型红细胞代替。5.洗出尽量多红细胞进行放散；注意放散的温度不可超过56，以防溶血；酸放散室温孵育时间必须在1-2分钟之间；天冷时放散液注意保温；尽可能多得放散液吸出；注意除去放散液中残留的红细胞；放散前红细胞要充分洗涤，至少三次。6.每日试验前，先取出微柱凝胶卡放置至室温。7.红细胞悬液的浓度应为0.8%，最高不超过1%。8.检测卡应放在18-25储存，如若长期放在4冰箱，建议每1-2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。,,临床遇到的一些问题及原因的分析,,问题1：正反定型卡反定型侧出现弱阳性结果原因及分析可能是一些特殊标本（如血液病、肿瘤病人和老年人等）抗体比较弱，有些大医院做过统计（当地10%左右的人群存在此情况），不同地区比例可能不同。处理方法加样后2-8 孵育1015分钟，可增加弱抗体检出率。,,问题2. 正反定型卡正定型结果阳性弱原因及分析可能是一些特殊疾病引起抗原减弱。处理方法加样后室温孵育1015分钟，可增加弱抗原检出率。,,问题3. 交叉配血阴性结果不好（假阳性，有1+或2+结果）原因及分析 a. 标本本身的问题（放置时间长、标本本身存在致敏现象、标本被污染）。 b. 低于实验要求温度或没有孵育，特别是在冬天很容易出现此问题。,,问题4. 正反定型不符原因及分析a. 一些特殊疾病引起。b. 新生儿抗体弱或无抗体。c. 抗原弱或亚型引起。,,问题5. 血型卡或抗人球卡出现混合凝集及疑似现象原因及分析a.不同血型相容性输血、骨髓移植和器官移植等。b.标本存放时间过长，存在一些细胞碎片、细胞团块或纤维蛋白（在胶上部形成红线或红色圆环）。c.亚型,,问题6. 母体效价卡结果各稀释度都为阳性原因及分析灭活不完全或者稀释度不够。处理方法重新灭活或先将血清标本稀释，取4+最高稀释倍数的血清用等量2-me灭活。,,问题7. 卡式法检测