郑海(95)双水相萃取技术提取过氧化物酶工艺研究

生物技术大实验论文生物技术大实验论文 论论文文题题目 双水相萃取技目 双水相萃取技术术提取提取过过氧化物氧化物酶酶工工艺艺研究研究 作者姓名 作者姓名 郑郑海海 指指导导老老师师 吴元喜 吴元喜 提交日期 提交日期 2007 年年 5 月月 目目 录录 摘要 Abstract 1 综述 1 1 开题背景 1 1 1 过氧化物酶 1 1 2 双水相萃取技术 1 2 国内外进展 2 方案论证 3 过程设计 3 1 实验流程 4 结果与讨论 4 1 预实验 4 2 正交实验 4 3 梯度实验 10 4 4 验证实验 11 4 5 超滤 11 4 6 凝胶过滤 12 4 7 电泳 12 5 结论与展望 12 5 1 工艺流程数据分析 12 5 2 结论及前景展望 13 致谢 13 参考文献 13 摘摘 要要 过氧化物酶 Peroxidase POD EC1 11 1 7 x 是一类以血红素为辅基的酶 在生物中广泛 存在 具有多种不同的生物功能 主要催化 H202和有机过氧化物对多种有机物和无机物的氧化作用 它在蛋白质 多肽 激素 病毒 寄生虫 生物降解及神经系统等方面都有应用 具有特异性强 灵 敏度高等优点 本文利用 PEG4000 NH4 2SO4双水相体系配合适当的工艺流程 从萝卜中提取纯化过氧化物酶 使过 氧化物酶纯化了 18 7 倍 得到的过氧化物酶比活为 110u mg 该方法具有反应条件要求温和 不需要 低温操作 总酶活回收率高 及整个流程可以实现循环等优点 具有较好的工业化前景 关键词关键词 过氧化物酶 双水相 超滤 凝胶过滤 Abstract Abstract Peroxidase POD EC1 11 1 7 C x is a kind of redox enzyme with hemoglobinas prostheric group which widely exists in organism and has many differentbiological functions It mainly catalyzes the oxidation of hydrogen peroxide andorganic peroxide with many inorganic and organic substances For the high specificityend sensitivity it is widely applied in protein polypeptide hormone virus parasite lignification biology degradation and neuro system etc PEG4000 NH4 2SO4 double aqueous phase system and appropriate process were used to extract POD from radish It made POD Purification 18 7 times the POD s activity was 110u mg this method have many advantages such as the reaction conditions is moderate and didn t need Low temperature operation high recovery and a cycle Process So it has good Industrialization prospects KeyKey words words POD double aqueous phase system ultrafiltration gel filtration 1 1 综述综述 1 11 1 开题背景开题背景 1 1 11 1 1 过氧化物酶过氧化物酶 1 1 1 11 1 1 1 过氧化物酶 peroxidase 是一种分解生物体某些代谢产物是分解生物体某些代谢物需氧脱 氢后所产生的对机体有害物质的一种酶 当有底物存在时 该酶能催化过氧化氢分解 使之不能在体内 过多地积累而产生伤害 因而它具有保护生物体的作用 同时 该酶又是一类以铁卟啉为辅基的酶 广布 于动 植物组织 在细胞代谢过程中起重要作用 除此之外 它还是植物生长及抗病重要生理生化指标 更为重要的是该酶又是酶作用机制中 中间产物学说的直接证据 1 1 1 1 21 1 1 2过氧化物酶 peroxidase 是最早发现的酶之一 广泛存在于生物界中 也是被广泛研究的一 类酶 2 大部分过氧化物酶都含有血红素 在催化过程中起到基础性作用 3 4 能催化H2O2或相关化合 物如O2和有机 无机化合物的氧化反应等 5 6 所以过氧化物酶在食品 医药 环保和化工等行业中已 得到广泛的应用 是需求量较大的工业用酶 如过氧化物酶在工业上可与过氧化氢共同用于橡胶成型 塑料及多泡沫性粘合剂的合成及纤维的漂白 并可以用于食品加工业的杀菌等等 7 1 1 1 31 1 1 3传统的过氧化物酶的提取方法主要是盐析法 其纯化效果好 酶比活稍高 但存在操作复杂 生产时间长 且大多时间都要求低温操作 丢失的酶量多 提取率低 不适宜工业化生产 8 1 1 21 1 2双水相萃取技术双水相萃取技术 1 1 2 11 1 2 1双水相萃取与水 有机相萃取的原理相似 都是依据物质在两相间的选择性分配 但萃取体系的 性质不同 当物质进入双水相体系后 由于表面性质 电荷作用和各种力 如憎水键 氢键和离子键等 的存在和环境的影响 使其在上 下相中的浓度不同 分配系数K 等于物质在两相的浓度比 各种物质 的K 值不同 例如各种类型的细胞粒子 噬菌体等分配系数都大于100 或小于0 01 酶 蛋白质等生 物大分子的分配系数大致在0 1 10 之间 而小分子盐的分配系数在1 0 左右 因而双水相体系对 生物物质的分配具有很大的选择性 9 1 1 2 21 1 2 2早在1896年 Beijerinck观察到 明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液混合时 得到一种不透明 的混合溶液 静置后可分为两相 上相中含有大部分的明胶 下相中含有大部分琼脂 或淀粉 这种现 象被称为聚合物的不相容性 从而产生了双水相 例如将2 2 质量分数 的葡聚糖水溶液与0 72 的甲基纤维素的水溶液等体积混合静置后 可以得到两个液层 下层含有71 8 的葡聚糖 上层含有90 3 的甲基纤维素 两相的主要成分都是水 10 由于双水相萃取条件较为温和 不会导致被分离物质的 失活 该技术已应用于生物大分子的分离和纯化 并且在生物小分子的分离 抗生素提取 中药中有效 成分提取分离 稀有金属 贵金属分离等方面的应用也取得了进展 在双水相体系中 常见的水溶性高 聚物有 聚乙二醇 PEG 聚丙二醇 甲基纤维素 聚丙烯乙二醇 吐温 聚氧乙烯类表面活性剂等 聚乙二醇 葡聚糖和聚乙二醇 无机盐是常用的双水相体系 由于葡聚糖格昂贵 聚乙二醇 无机盐体系应 用更为广泛 11 1 1 2 31 1 2 3基于双水相的以下一些特点 其在生物高分子的分离中的应用越来越广泛 1 含水量高 70 90 在接近生理环境的体系中进行萃取 不会引起生物活性物质失活或变性 2 可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质 还能不经过破碎直接提取细胞内酶 省 略了破碎或过滤等步骤 3 分相时间短 自然分相时间一般为5 min 15 min 4 界面张力小 10 7 10 4mN m 有助于两相之间的质量传递 界面与试管壁形成的接触角几 乎是直角 5 不存在有机溶剂残留问题 高聚物一般是不挥发物质 对人体无害 6 大量杂质可与固体物质一同除去 7 易于工艺放大和连续操作 与后续提纯工序可直接相连接 无需进行特殊处理 8 操作条件温和 整个操作过程在常温常压下进行 9 亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性 1 21 2国内外进展 国内外进展 1 2 1 11 2 1 1目前国内外对过氧化物酶的提取主要的方法都以盐析作为最重要的步骤 其原理是利用过氧化 物酶可溶于水 溶解度约为5 W V 且在0 58 饱和度以下的硫酸铵溶液中可溶 而在0 62 饱和度 以上不溶 可据此用分步盐析的方法 再用有机溶剂丙酮进行分步沉淀可制备出较高活力的过氧化物酶 制剂 其具体流程分为以下几步 1 初酶液的制备 2 加入226g L NH4 2SO4盐析 收集上清 3 加入258g L NH4 2SO4盐析 收集沉淀 4 蒸馏水溶解 透析除盐 5 丙酮分级沉淀 收集沉淀 6 加入少量蒸馏水溶解 透析除丙酮 经上述几个步骤就可以得到纯度较高的过氧化物酶 8 近年来 有不少的工艺流程中采用了离子交换树脂层析 凝胶过滤等一些步骤来进一步提高过氧化物 酶的纯度 但是盐析仍旧是整个工艺流程中必不可少的一步 盐析步骤的存在使得整个流程对温度要 求比较苛刻 温度过高则容易导致酶的失活 同时盐析步骤的回收率较低 且无法实现循环操作 这 样导致目前过氧化物酶的市场价格一直较高 1 2 2 11 2 2 1双水相萃取由于其独特的优势 目前在分离和提纯生物物质中得到了充分的使用 主要分为以 下几个方面 分离和提取各种蛋白质 酶 双水相萃取技术成功地用于分离和提纯蛋白质 牛血清蛋白 BSA 在聚乙二醇 硫酸盐的双水相系中 的分配表明 一般情况下 BSA 适宜于分配在下相 pH 值的变化对分配系数影响不大 外加NaCl 对BSA 在两相中的分配产生很大的影响 由通常的BSA 宜分配于下相转变成宜分配于上相及上相表层 通过改 变起始BSA 在溶液中的总浓度 得到平衡时上 下相BSA 浓度随起始BSA 总浓度变化的曲线方程 上相 宜用 饱和型 方程表示 下相适合用线性方程表示 将上 下相BSA 浓度之比得到的平衡常数K 的表 达式与实验数据拟合较好 真菌脂肪酶在PEG 硫酸铵双水相体系中的分配中 PEG 分子量 PEG 浓度 NH4 2SO4浓度 NaCl 等因素对脂肪酶和总蛋白分配系数 酶活回收率 相体积比均有影响 实际表明用14 16 W W PEG1000 和12 14 W W NH4 2SO4 NaCl 为零所组成的双水相体系 在室温下对脂肪酶的 提取率可达71 分配系数可达1 7 提纯倍数为1 5 以PEG 硫酸铵双水相体系 经一次萃取从 一淀粉酶发酵液中分离提取 一淀粉酶和蛋白酶 萃取最适宜的条件为15 PEG1000 20 NH4 2SO4 pH 8 一淀粉粉酶收率90 分配系数为19 6 与蛋白酶的分离系数高达15 1 比活 率为原发酶液的1 5 倍 蛋白酶在水相中的收率高于60 该法与传统的提取法相比 可直接处理发酵 粗滤液 提高工效 降低能耗和酶活损失 12 M nica等利用聚乙二醇 PEG 磷酸盐双水相体系提取天然发酵物中的碱性木聚糖酶 确定最佳体系是 22 PEG6000 10 K2 HPO4和12 NaCl 活性酶的产率可达98 13 除此以外 在近几年的报道中双 水相萃取已用于多种蛋白质和生物酶的分离 如牛血清蛋白 BSA 牛酪蛋白 乳球蛋白 血清 蛋白 淀粉酶和蛋白酶 胆固醇氧化酶 脂肪酶 磷酸甘油酸激酶 PGK 和磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH 葡糖淀粉酶 L 天门冬酰胺酶等都在双水相体系中得到较好的分离 提取抗生素和分离生物粒子 用双水相技术直接从发酵液中将丙酰螺旋酶素与菌体分离后进行提取 可实现全发酶液萃取操作 采用 PEG Na2HPO4 体系 最佳萃取条件是PH 8 0 8 5 PEG2000 14 Na2HPO4 18 小试收率 达69 2 对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53 4 PEG不同相对分子量对双水相提取丙酰螺旋酶 素的影响不同 适当选择小的相对分子质量的PEG有得于减小高聚物分子间的排斥作用 并能降低体系粘 度 有利于抗生素的分离 14 双水相电泳分离氨基酸 近几年来 随着生物技术的迅速发展 制备型电泳技术的研究受到了广泛的重视 Morre研究了用双水相 和自由流动电泳对核内体的分配 提出只用制备型自由流动电泳就可以溶解核内体 而不需要相分离的 方法 15 表面活性剂双水相的应用 由头基较大的一种季铵盐型阳离子表面活性剂与另一种阴离子表面活性剂按一定比例和浓度混合而成 的新颖双水相体系 作为一种液 液萃取体系用于低浓度 痕量成份的分离检测 其操作简便 快 捷 该体系由于仅含有很稀 浓度的表面活性剂 总表面活性浓度低于1 W W 生物活性物质在其中分配不易失活变性 因此 在对生物活性物质在其中分离 纯化等方面表现出来了特有的应用价值 1 2 2 21 2 2 2用于生物分离的双水相高分子聚合物体系常见的有PEG Dextran和PEG Dextran硫酸盐体系 高聚物 无机盐体系有PEG 硫酸盐和PEG 磷酸盐体系 2 2 方案论证 方案论证 过氧化物酶的分子量大约为40KD 属于具有生物活性的蛋白质 从原理上可以利用双水相来进行提取 和纯化 考虑到成本 采用PEG4000 硫酸铵双水相体系来进行实验 2 12 1为了与传统的盐析法进行对比 进一步了解盐析法和双水相萃取的优劣之处 在实验的第一步进行 对比实验 2 22 2根据PEG4000 硫酸铵双水相体系的相图 以PEG浓度和硫酸铵浓度为考虑因子 各选择3个适当水平 离分相线有一定距离 但又不至于太远 进行正交实验 确定PEG浓度和硫酸铵浓度这两个因素的相 对重要性 2 32 3以相对重要的一个因素作为变量 另一个因素使用正交实验的最佳水平 进行单因子实验 得到使 过氧化物酶主要分配在上相 PEG相 和下相 硫酸铵相 的最佳浓度值 2 42 4采用PEG6000验证双水相效果 2 52 5根据实验的结果设计适当的流程 以双水相萃取的方法为核心技术对过氧化物酶进行分离和提纯 测定最后的酶活 纯度 回收率 3 3 过程设计过程设计 实验流程 实验流程 试验材料 试验材料 白萝卜 白菜 冬瓜 胡萝卜 仪器 仪器 烧杯 试管 玻璃棒 量筒 分液漏斗 离心机 冷冻离心机 电泳仪 分光光度计 离子交换柱层 析仪 透析膜 主要试剂主要试剂 PEG4000 PEG6000 NH4 2SO4 愈创木酚 过氧化氢 考马斯亮蓝R 250 考马斯亮 蓝G 250 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 Tris HCl 甘氨酸 TEMED 磺基水杨酸 冰乙酸 Sephadex G 75凝胶 3 13 1采用盐析法和双水相萃方法两种不同的方法 先进行对比试验 以初步了解双水相萃取方法的提纯 效果同盐析法相比有何区别 具体流程如下 3 1 13 1 1称取新鲜干净蔬菜各500克 捣碎后分别放入烧杯 定容至1000ml 3 1 23 1 2将烧杯放入 4 的冰箱中浸提2小时 3 1 33 1 3抽滤 去除沉淀 并量取所得上清的体积 计算提取液与新鲜植株体积重量比 W V 3 1 43 1 4取少量测定其酶活和蛋白含量 将其中过氧化物酶酶活最高的一种植物提取液用来做下面步骤的 提取纯化工艺研究 3 1 53 1 5传统盐析方法 将一份上清液按226g L加入 NH4 2SO4盐析 于冰箱中静置1h 5000rpm低温离 心10min去除沉淀 上清液再按258g L加 NH4 2SO4盐析 冰箱中静置过夜 以5000rpm低温离心 收 集沉淀 用少量蒸馏水溶解 透析除盐 酶液在搅动下沿着杯壁按1 1加入预冷 15 的丙酮 冰 箱中静置30min 低温离心去沉淀 再按上清液与丙酮之比为1 0 8再次加入预冷丙酮 冰箱静置30min 后低温离心收集沉淀 加少量水溶解 透析去除丙酮 量取酶液体积 测酶活和蛋白含量 过氧化物 酶可溶于水 溶解度约为5 W V 且在0 58饱和度以下的硫酸铵溶液中可溶 而在0 62饱和度以上 不溶 可据此用分步盐析的方法 再用有机溶剂丙酮进行分步沉淀 3 1 63 1 6双水相萃取方法 一份上清液在搅动中缓慢加入试剂使形成12 W V PEG4000 12 W V NH4 2SO4体系 充分搅拌至溶解 转移至分液漏斗中静置萃取2h 取下相 盐相 测酶活和蛋白含 量 3 23 2 根据步骤1所得到的试验结果选择过氧化物酶含量最高的植物为试验材料进行正交实验 具体步 骤如下 3 2 13 2 1 制备粗酶液 见见3 1 13 1 1 3 1 23 1 2 3 1 33 1 3 并测酶活 3 2 23 2 2 取9份相等量的粗酶液 并记录粗酶液体积 编号1 9 3 2 33 2 3 按表3 1加入相应的试剂 并搅拌至充分溶解 表3 1 因素PEG浓度 W W 硫酸铵浓度 W W 实验1 15 10 实验2 15 15 实验3 15 20 实验4 20 10 实验5 20 15 实验6 20 20 实验7 25 10 实验8 25 15 实验9 25 20 3 2 43 2 4 转移至分液漏斗中静置萃取2h 取下相 盐相 测定酶活和蛋白含量 3 2 53 2 5 计算过氧化物酶在两相之间的分配系数 通过数据处理 找出PEG浓度和硫酸铵浓度这两个因素 中的主要因素 并找出通过正交实验得到次要因素的最佳水平 3 33 3 对步骤2所得到对过氧化物酶在两相中分配系数影响最大的因子进行单因子多阶实验 以进一步 扩大过氧化物酶在两相中的分配系数 具体流程如下 3 3 13 3 1 制备粗酶液 见见3 1 13 1 1 3 1 23 1 2 3 1 33 1 3 并测酶活 3 3 23 3 2 取3份相等量的粗酶液 并记录粗酶液体积 编号1 3 3 3 33 3 3 按表3 2条件加入相应的试剂 并搅拌至充分溶解 表3 2 根据表3 1实验结果知硫酸铵浓度为主要影响因素 编号PEG4000 W W 硫酸铵 W W 115 8 5 215 10 315 12 3 3 43 3 4 转移至分液漏斗中静置萃取2h 取下相 盐相 测定酶活和蛋白浓度 3 3 53 3 5 计算过氧化物酶在两个相中的分配系数 找到在上相的最大分配系数和在下相的最大分配系数 所对应的因素水平 3 43 4 采用PEG6000验证双水相效果 具体流程如下 3 4 13 4 1 制备粗酶液 见见3 1 13 1 1 3 1 23 1 2 3 1 33 1 3 并测酶活 3 4 23 4 2 取3份相等量的粗酶液 并记录粗酶液体积 编号1 3 3 4 33 4 3 按表3 3条件加入相应的试剂 并搅拌至充分溶解 表3 3 编号PEG6000 硫酸铵 W W 115 8 215 10 315 12 3 4 43 4 4 转移至分液漏斗中静置萃取2h 取下相 盐相 测定酶活和蛋白浓度 3 4 53 4 5 计算过氧化物酶在两个相中的分配系数 找到在上相的最大分配系数和在下相的最大分配系数 所对应的因素水平 3 43 4根据步骤3的试验结果 配合适当的工艺流程进行实验 具体步骤如下 3 4 13 4 1 制备粗酶液 见见3 1 13 1 1 3 1 23 1 2 3 1 33 1 3 并测酶活 3 4 23 4 2 按步骤3 3得到的最佳双水相体系进行双水相萃取 3 4 33 4 3 静止分相后取下相 记录下相体积 3 4 43 4 4 超滤 截留分子量10KD 除去硫酸铵和PEG4000 取浓缩液 3 4 53 4 5 浓缩液过Sephadex G 75凝胶 层析柱为1 6cm 50cm 进一步除去杂质蛋白 采用记录仪记录 相应数据 3 53 5 电泳分析 将酶的粗提液 双水相萃取下相组分 超滤所得浓缩液 凝胶过滤所得POD溶液四种溶液 采用PAGE进 行分析 分离胶浓度10 浓缩胶浓度3 75 分离胶段电流18mA 浓缩胶段电流10mA 附 酶活 酶蛋白浓度的测定方法附 酶活 酶蛋白浓度的测定方法 A 酶活的测定 将各酶液适当稀释 利用过氧化物酶在过氧化氢存在下能催化愈创木酚反应形成有色物质的特性 按附表 1 进行各样品酶活性的测定 附表附表 1 1 酶活测定的操作 各试剂加入量单位为酶活测定的操作 各试剂加入量单位为 mlml 管号0 2M 磷酸缓 冲液 PH 6 0 0 05 愈创木 酚 酶液0 04 过氧 化氢 水 111101 211100 300010 在 37 保温 10min 管 1 作为对照在时间扫描 470nm 调好零点 混合管 2 和管 3 即倒入比色杯 中进行 470nm 光吸收的时间扫描 读取 30 或 60 或 90 秒 直线部分 的 O D 值 按下列公式计算出 酶比活及总酶力 酶比活 O D 470nm 稀释倍数 蛋白含量 mg 时间 min 酶总活力 比活 酶蛋白量 B 酶蛋白浓度测定 采用考马斯亮蓝G 250方法和紫外分光法测定酶蛋白浓度 a 考马斯亮蓝G 250方法既标准曲线法 先在一定的蛋白浓度范围内取一定数目的点 利用考马斯亮 蓝G 250与蛋白质反应使之形成蓝色络合物 利用分光光度记测定595nm处吸光度 作出标准曲线 b 紫外分光法方法如下 将各待测酶液适当稀释在紫外光区进行吸收光谱扫描 读取 280nm 和 260nm 处的 O D 值 用以下公式计算 蛋白浓度 mg ml 1 45A280 0 74A260 稀释倍数 蛋白含量 mg 蛋白浓度 酶液体积 4 4 结果与讨论结果与讨论 4 14 1 预实验预实验 测得萝卜中过氧化物酶含量为 10 89u g 萝卜中蛋白含量为 1 85mg g 萝卜中过氧化物酶的比活为 5 89u mg 通过 PEG 种类选择预实验发现 PEG4000 和 PEG6000 较适合过氧化物酶的提纯且差别不大 由于 PEG6000 的黏度较 PEG4000 要大 工艺放大较不方便 故采用 PEG4000 进行研究 4 24 2 正交实验确定影响过氧化物酶纯化倍数和回收率的主要因素正交实验确定影响过氧化物酶纯化倍数和回收率的主要因素 考虑 PEG4000 浓度和 NH4 2SO4浓度两个因素 根据 PEG4000 NH4 2SO4相图选择适当的水平进行 两因素三水平的全阶实验 共 9 组实验 整个双水相体系重 20g 其中原酶提取液占 5g 结果见表 4 1 纯化倍数和回收率以双水相下相数据计算 表 4 1 Exp NUM PEG4000 W W NH4 2SO4 W W 纯化 倍数 回收率 115 10 6 5290 12 215 15 3 6558 61 315 20 1 2227 61 420 10 4 6860 38 520 15 1 5622 62 620 20 0 435 64 725 10 2 9440 88 825 15 0 626 98 925 20 0 546 30 由于要考察多重指标 结合现代生物统计原理和优序计算权重系数法则设定双水相系统萃取整体 效果好坏评分依据 Total score 纯化倍数 回收率 1 极差分析图 图 4 1 1 为 PEG 浓度极差 2 为 NH4 2SO4浓度极差 极差分析图 0 0 5 1 1 5 2 2 5 3 3 5 12 极差 系列1 系列2 系列3 图 4 1 2 方差分析 见表 4 2 表 4 2 因素偏差平 方和 自由 度 F比F临 界值 PEG浓度 8 95824 54519 硫酸铵浓度 16 63028 43719 误差 1 972 极差分析和方差分析均表明在影响过氧化物酶在双水相中的分配的因素中 NH4 2SO4浓度占主要因素 4 34 3 梯度放大实验梯度放大实验 固定 PEG4000 浓度为正交实验最佳浓度 15 W W 取正交最佳 NH4 2SO4浓度及上下各一个浓度梯 度 将双水相体系由原来的 20g 放大到 100g 结果见表 3 表 4 3 Exp NUM NH4 2SO4浓度 纯化 倍数 回收率 18 5 4 5455 38 210 6 6489 2 312 7 7585 42 通过该实验发现 12 的 NH4 2SO4浓度的纯化倍数最高 但是其过氧化物酶回收率不及 10 NH4 2SO4浓度的高 针对这个问题可以采用二次萃取来解决 4 4PEG60004 4PEG6000 梯度实验验证梯度实验验证 通过预实验发现过氧化物酶在 PEG6000 NH4 2SO4和 PEG4000 NH4 2SO4中的分配较为相似 故采用 PEG6000 NH4 2SO4体系考察实验结果的可信度 结果见表 4 PEG6000 浓度固定为 15 表 4 4 Exp NUM NH4 2SO4浓度 纯化 倍数 回收率 18 0 4 7188 82 210 7 0488 84 312 9 1870 71 4 54 5 超滤超滤 利用 PEG4000 15 W W NH4 2SO4 12 W W 双水相体系重量 500g 原酶液量 125g 双水相萃取 所得下相物质进行超滤 截留分子量 10000 结果见表 5 表 4 5 Exp NUM 进样量 ml 总酶活 u 浓缩液量 ml 浓缩液总 酶活 浓缩倍数回收率 12341163 241889 75 776 5 4 64 6 凝胶过滤凝胶过滤 采用 Sephadex G 75 凝胶 15mm 50mm 层析柱 1ml min 的洗脱速度 300min 的洗脱时间进行凝胶过 滤 并利用自动记录仪记录实验结果 结果见图 4 2 图 4 2 合并过氧化物酶酶的试管 冷冻干燥后用适当蒸馏水稀释测定其酶活 得凝胶过滤步骤过氧化物 酶的回收率为 92 4 74 7 电泳分析电泳分析 将原酶液 双水相 超滤后浓缩液 凝胶过滤后酶液用 PAGE 分析 其结果见图 3 图 4 3 5 5 结论与展望结论与展望 5 15 1 工艺流程数据分析表工艺流程数据分析表 表 5 1 表 5 1 工艺流程蛋白浓度 mg ml 酶活 u ml 体积 ml 酶比活 u mg 纯化倍 数 回收率 原酶液 1 850010 891255 891100 双水相萃取 0 10854 9723445 817 7885 43 超滤 0 205021 5841105 2717 8765 00 凝胶过滤 0 00720 7931025110 118 7059 69 5 25 2 结论及前景展望结论及前景展望 采用PEG4000 15 W W 硫酸铵 12 W W 双水相体系结合超滤 截留分子量为10000 和凝胶过滤 从萝卜提取液中提纯过氧化物酶能使过氧化物酶纯化使18 7倍 得到的过氧化物酶比活为110u mg 该 方法具有反应条件要求温和 不需要低温操作 总酶活回收率高 及整个流程可以实现循环等优点 具有较好的工业化前景 致谢致谢 本论文是在吴元喜老师的悉心指导下完成的 从论文的选题 文献查阅 实验设计 实验开展到撰写 论文的整个过程中 倾注了吴元喜老师大量的心血 使学生倍受鼓舞并表示无限的感激 吴元喜老师 渊博的知识 丰富的研究经验 严谨的治学态度和不断创新进取的精神 更使我由衷的钦佩 这将永 远激励着学生更加努力的学习和工作 在一个多月的时间里 实验室的各位老师给予了我许多热情的帮助 在这里特别感谢刘凌老师 刘幸 福老师和周爱文老师 谢青老师在实验仪器和药品方面给予我的支持和帮助 同时也要感谢05级的生 化实验小老师们在药品方面给予我的帮助 在此一并表示感谢 最后感谢家人多年来对我一如既往的支持 参考文献参考文献 1 罗纪盛 张丽萍 杨建雄等编 生物化学教程 M 第三版 北京高教出版社 2 Maria Estela Silva Telma Teixeira France Purification of soybeanperoxidase Glycine max by metal affinity partitioning in aqueoustwo2phase systems J Journal of Chromatography B 200