凝胶电泳实验报告模板

重庆大学研究生专业实验教学重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书实验报告书 重庆大学研究生院制 实验课程名称 实验课程名称 凝胶电泳实验凝胶电泳实验 实验指导教师 实验指导教师 学学 院 院 专业及类别 专业及类别 生物学生物学 学学 号 号 姓姓 名 名 实验日期 实验日期 成成 绩 绩 一 实验目的一 实验目的 1 理解凝胶电泳的分类及琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的基本原理 2 熟练琼脂糖凝胶电泳实验的基本操作 3 通过实验了解凝胶电泳实验的注意事项并在以后的实验中尽量避免 4 利用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度 浓度和分子量以及分离大小不同的 DNA 片段 5 了解聚丙烯酰胺凝胶电泳测定 DNA 和蛋白分子量大小的方法 二 实验材料 用具及试剂二 实验材料 用具及试剂 1 材料 菌落 PCR 产物 待检测 DNA 片段 2 用具 琼脂糖凝胶电泳 电泳仪 水平板型电泳槽 电子天平 微量移液器 10 l 枪头 三角瓶 点样板 梳子 微波炉 凝胶成像仪 聚丙烯酰胺凝胶电泳 垂直板电泳槽 稳压稳流电泳仪 梳子 3 试剂 琼脂糖 1 TAE 缓冲液 载样缓冲液 Loading buffer goldviwe 染 料 DL5 000 DNA Marker Takara 三 实验原理三 实验原理 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一 用于分离 鉴定和纯化 DNA 或 RNA 片段 具有以下优点 便于分离 便于检测和便于回收 其工作原理相对而 言比较简单 主要用到了物理学的电荷理论 当一种分子被放置在电场当中时 它们就会以一定的速度移向适当的电极 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度 叫做电泳的迁移率 它同电场的强度和 电泳分子本身所携带的净电荷数成正比 也就是说 电场强度越大 电泳分子所 携带的净电荷数量越多 其迁移的速度也就越快 反之则较慢 由于在电泳中使 用了一种无反应活性的稳定的支持介质 如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等 从而 降低了对流运动 故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的 已知摩擦系 数是分 子的大小 极性及介质粘度的函数 因此根据分子大小的不同 构成或 形状的差异 以及所带的净电荷的多少 便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混 合物中的各种成分彼此分离开来 在生理条件下 核酸分子的糖 磷酸骨架中的 磷酸基因呈离子状态从这种意义上讲 D N A 和 RNA 多核苷酸链可叫做多聚阴 离子 Polyanions 因此 当核酸分子被放置在电场中时 它们就会向正电极 的方向迁移 由于糖 磷酸骨架结构上的重复性质 相同数量的双链 DNA 几乎 具有等量的净电荷 因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移 在一定的电场 强度下 DNA 分子的这种迁移速度 亦即电泳的迁移率 取决于核酸分子本身的 大小和构型 分子量较小的 DNA 分子比分子量较大的 DNA 分子迁移要快些 这就是应用凝胶电泳技术分离 DNA 片段的基本原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳 普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸 琼脂糖凝胶 孔径较大适用于分离同工酶及其亚型 大分子核酸等应用较广 琼脂糖和聚丙烯 酰胺可以制成各种形状 大小和孔隙度 琼脂糖凝胶分离 DNA 度大小范围较广 不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从 200bp 至近 50kb 的 DNA 段 琼脂糖通常用水 平装置在强度和方向恒定的电场下电泳 聚丙烯酰胺分离小片段 DNA 5 500bp 效 果较好 其分辩力极高 甚至相差 1bp 的 DNA 段就能分开 聚丙烯酰胺凝胶电泳很 快 可容纳相对大量的 DNA 但制备和操作比琼脂糖凝胶困难 聚丙烯酰胺凝胶采 用垂直装置进行电泳 目前 一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行 DNA 电泳 3 1 凝胶电泳的分类凝胶电泳的分类 按照分离物质来分凝胶电泳可以分为核酸凝胶电泳和蛋白质凝胶电泳 按照 分离介质来分可以分为琼脂糖凝胶电泳技术和 PAGE 凝胶电泳 本次实验我们采 用按介质的分类方法来学习的 3 1 1 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法 其分析原理与其他 支持物电泳的最主要区别是 它兼有 分子筛 和 电泳 的双重作用 琼脂糖凝胶具有网络结构 物质分子通过时会受到阻力 大分子物质在涌动 时受到的阻力大 因此在凝胶电泳中 带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质 和数量 而且还取决于分子大小 这就大大提高了分辨能力 但由于其孔径相当 大 对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道 现广泛应用于核酸的研究中 蛋白质和核酸会根据 pH 不同带有不同电荷 在电场中受力大小不同 因此 跑的速度不同 根据这个原理可将其分开 电泳缓冲液的 pH 在 6 9 之间 离子 强度 0 02 0 05 为最适 常用 1 的琼脂糖作为电泳支持物 琼脂糖凝胶约可区分 相差 100bp 的 DNA 片段 其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低 但它制备容易 分离 范围广 普通琼脂糖凝胶分离 DNA 的范围为 0 2 20kb 利用脉冲电泳 可分离高 达 107bp 的 DNA 片段 3 1 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验室中常采用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE SDS PAGE 是蛋白分 析中最经常使用的一种方法 它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠 SDS 以及巯基乙醇一起加热 使蛋白变性 多肽链内部的和肽链之间的二硫 键被还原 肽链被打开 打开的肽链靠疏水作用与 SDS 结合而带负电荷 电泳时 在电场作用下 肽链在凝胶中向正极迁移 不同的大小的肽链由于在迁移时受到 的阻力不同 在迁移过程中逐渐分开 其相对迁移率与分子量的对数间成线形关 系 SDS PAGE 可分为圆盘状和垂直板状 连续系统和不连续系统 本实验采用 垂直板状不连续系统 其基本原理如下 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分 pH 值和凝胶孔径 而 且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀 由此产生的浓缩效应 电荷效应和分 子筛效应 浓缩效应 样品在电泳开始时 通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层 一般能浓缩几百倍 然后再被分离 当通电后 在样品胶和浓缩胶中 解离度最大的 Cl 有效迁移率 最大 被称为快离子 解离度次之的蛋白质则尾随其后 解离度最小的甘氨酸离 子 PI 6 0 泳动速度最慢 被称为慢离子 由于快离子的迅速移动 在其后边形 成了低离子浓度区域 即低电导区 电导与电势梯度成反比 因而可产生较高的 电势梯度 这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动 因而在高 电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面 由于样品中蛋白质的有效 迁移率恰好介于快 慢离子之间 所以 也就聚集在这个移动的界面附近 逐渐 被浓缩 在到达小孔径的分离胶时 已形成一薄层 电荷效应 当各种离子进入 pH8 9 的小孔径分离胶后 甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋 白质 高电势梯度也随之消失 在均一电势梯度和 pH 的分离胶中 由于各种蛋 白质的等电点不同 所带电荷量不同 在电场中所受引力亦不同 经过一定时间 电泳 各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带 分子筛效应 由于分离胶的孔径较小 分子量大小或分子形状不同的蛋白质通 过分离胶时 所受阻滞的程度不同 因而迁移率不同而被分离 此处分子筛效应是指样品通过 一定孔径的凝胶时 受阻滞的程度不同 小分子走在前面 大分子走在后面 各 种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带 3 1 3 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点 琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 因不含硫酸根和羧基 几 乎消除了琼脂的电渗 2 对蛋白质吸附极微 故无 拖尾现象 3 凝胶结构均匀 孔径较大 可用于分离酶的复合物 核酸 1 PAGE 具有电泳和分子筛 的双重作用 2 PAGE 是目前最常用的电 泳方法 3 设备简单 4 样品量小 1 100ug 特点 病毒等大分子物质 4 透明度较好 可直接或干 燥成薄膜后进行染色 5 不吸收紫外光 可直接利 用紫外吸收法做定量测定 6 有热可逆性 7 易破碎 浓度不能太低 8 易被细菌污染 不易保存 临用前配置 9 琼脂糖支持层上的区带易 于扩散 电泳后必须立即固定染 色 10 与 PAGE 相比 分子筛 作用小 区带少 5 时间短 30 60min 6 操作方便 7 分离范围广 多肽 蛋白 多糖等 8 可提高灵敏度改为超微量 测定 10 12 10 9 9 可用于蛋白质分子量测定 3 2 影响影响 DNA 迁移速率的决定因素迁移速率的决定因素 1 DNA 分子的大小 双链 DNA 分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成 反比 2 琼脂糖浓度 浓度越低 相同核酸分子迁移越快 表 1 不同类型和浓度琼脂糖分离 DNA 片段的范围 浓 度 标 准 kb 高强度 kb 低熔点 kb 0 31 50 0 50 7 25 0 80 5 150 8 100 8 10 10 25 120 4 80 4 8 1 20 15 60 3 70 3 7 1 50 08 40 2 40 2 4 20 1 30 1 3 30 05 1 4 6 3 DNA 的构象 同一分子的迁移速率 超螺旋环状 线状 切口环状 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭 EB 插入双链 DNA 造成其负电荷 减少 刚性和长度增加 5 所用的电压 低电压时 DNA 片段迁移率与所用的电压成正比 3 3 常见琼脂糖种类及性质常见琼脂糖种类及性质 常见琼脂糖的种类有两种 分别为 标准琼脂糖和低熔点琼脂糖 表 2 不同类型琼脂糖的性质 琼脂糖类型凝结温度 熔化温度 35 3890 95标准琼脂糖 40 4285 90 34 43 25 35 85 95 63 65 高强度琼脂糖 修饰的低熔点 凝 点琼脂糖3565 超低熔点8 1540 45 25 3070 3885 低黏性低熔点琼脂 糖 3075 不同厂家生产的不 同商品其凝结温度 和熔化温度有一定 差异 3 4 电泳缓冲液电泳缓冲液 电泳缓冲液是指在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液 用以稳定体系酸碱度 同 时电泳缓冲液的另外一个重要作用是使溶液具有一定的导电性 以利于 DNA 分子 的迁移 常用的电泳缓冲液有 TAE Tris 乙酸 缓冲液 TBE Tris 硼酸 缓 冲液 两者的区别主要有以下几点 1 TAE 的缓冲容量最低 如长时间电泳会被消耗 此时凝胶的阳极一侧将发生 酸性化 2 TBE 比 TAE 花费稍贵 但有高得多的缓冲容量 3 双链线状 DNA 片段在 TAE 中比在 TBE 中迁移快 10 4 对于高分子质量的 DNA TAE 的分辨率略高于 TBE 对于低分子质量的 DNA TAE 要差些 超螺旋 DNA 在 TAE 中的电泳分辨率要好于 TBE 3 5 凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液 载样缓冲液是临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液 在电泳时具有以下作用 1 增加样品密度保证 DNA 沉入加样孔内 2 使样品带有颜色便于简化上样过程 3 其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移 表 3 6 凝胶载样缓冲液 类型6 缓冲液贮存温度 0 25 溴酚蓝 0 25 二甲苯氰 FFI 40 m V 蔗糖水溶液 4 0 25 溴酚蓝 0 25 二甲苯氰 FFII 15 Ficoll Type400 水溶液 室温 0 25 溴酚蓝 0 25 二甲苯氰 FFIII 30 甘油水溶液 4 0 25 溴酚蓝IV 40 m V 蔗糖水溶液 4 3 63 6 核酸染料核酸染料 电泳后 核酸需经染色才能显色出带型 溴化乙锭 ethidium bromide EB 是最常用的核酸染色剂 灵敏度高 它可嵌入核酸双链的配对碱基之间 在紫外 线激发下 发出桔红色荧光 EB DNA 复合物中的 EB 发出的荧光 比游离的凝胶 中的 EB 发出的荧光强度大 10 倍 因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型 但 是 EB 是致癌物 对人体有害 操作时应小心保护 使用 EB 时的注意事项主要有 1 EB 被认为是一种强致癌物质 2 EB 可用来检测单链或双链核酸 3 EB 使用时的配制 贮存及使用 EB 常用水配制成 10 mg ml 的贮存液 于 室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中 使用终浓度为 0 5 g ml 4 当要知道 DNA 片段准确大小时 凝胶应在无 EB 情况下电泳 电泳结束后再 用 EB 染色 针对 EB 的强致癌性 公司开发了很多其他比较安全的核酸染料 GoodView 是目前使用量较多的一款 它与 DNA 发生结合并产生很强的荧光信号 灵敏度与 EB 相当 使用方法与之完全相同 在紫外透射光下双链 DNA 呈现绿色荧光 而 单链 DNA 呈现红色荧光 GoldView 特别适合大片段 1 kb DNA 的检测 灵敏 度高 也可用于 RNA 的染色 但是在针对小片段的检测效果不如 EB 四 实验步骤四 实验步骤 4 14 1 PCRPCR 产物的准备产物的准备 表 4 菌落 PCR 反应体系 2 Taq mix 5ul94 5min T7引物 0 25ul94 30s AD 3 引物 0 25ul57 30s30 三蒸水 4 5ul72 40s 模板 菌落72 5min Total 10ul4 10min PCR体系反应条件 按照表 4 的体系和程序进行 PCR 扩增 扩增的的结果用于凝胶电泳实验 4 24 2 凝胶电泳凝胶电泳 4 2 14 2 1 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 胶浓度的选取 取决于待检测 DNA 片段大小 如下表 表 5 凝胶浓度所对应的线性 DNA 长度 凝胶浓度 线性DNA长度 bp 0 51000 30000 0 7800 12000 1 0500 10000 1 2400 7000 1 5200 3000 2 050 2000 本实验中 DNA 片段大小包含在 500 10000 之间 所以选取 1 0 的胶浓度 琼脂糖称取 其所需取决于所用胶板大小 40ml 80ml 160ml 和浓度 常用范围 0 8 2 0 凝胶浓度 琼脂糖质量 g 胶板体积 ml 本实验中 胶板大小为 40ml 凝胶浓度为 1 0 所以称取 0 4g 琼脂糖 TAE 缓冲液配制 50 TAE Tris 242g Na2EDTA 37 2g 冰醋酸 57 1ml 加水定容至 1L 1 TAE 将上述液体稀释 50 倍 凝胶的制备 将琼脂糖加入盛有所需体积电泳缓冲液的三角烧瓶中 用塞子塞住三角烧瓶颈部 在微波炉中加热至琼脂糖融化 取出待融化的凝胶冷却至 65 左右加入核酸染料 至终浓度 0 5 g ml 轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液 琼脂糖溶液冷却时 用一个合适的梳子插入凝胶托板 置于水平板上 灌入湿热的琼脂糖溶液进入模具至凝胶溶液完全凝结 拔出梳子 安放到 电泳槽内 添加 1 TAE 电泳缓冲液至没过胶板约 1mm 为止 等待加样 提前将凝胶 放入到缓冲液中 有利于凝胶中的缓冲体系和外界平衡 加样 用 10 l 微量移液器吸取 3 l Loading buffer 于 PE 手套上 再吸取 5 l PCR 产物 将其与 Loading buffer 混匀 然后将上述混合液加入到凝胶板的点样孔内 加样时要注意不要弄破凝胶 以防止样品漏出 电泳 加样后的凝胶板立即通电进行电泳 电压 60 100V 样品由负极 黑色 向 正极 红色 方向移动 当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm 处时 停止电泳 观察与拍照 254nm 紫外灯下初步观察 凝胶成像系统详细观察 拍照 4 2 24 2 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 安装夹心式垂直板电泳槽 配胶 制备凝胶板 样品的处理及加样 电泳 染色与脱色 结果处理 五 实验结果及分析五 实验结果及分析 琼脂糖凝胶电泳结果如图 1 所示 图图 1 琼脂糖凝胶电泳图琼脂糖凝胶电泳图 电泳结果显示 扩增出目的条带 电泳条带出现拖尾现象 结果分析如下 从图 1 中可以看出 本次实验跑出了条带 但是存在很多的问题 Mark 跑的 效果比较差 起到的指示作用相对而言也就比较差 同时 PCR 产物的各条带也不 亮 拖尾现象比较严重 红线框标定的条带为我们组的实验结果 结果显示有轻 微的拖尾现象 并且条带不太亮 针对实验中出现的各种问题 现将原因总结如 下 拖尾在目的条带的前面 原因可能是 样品破碎或是被降解 样品 DNA 本身不纯 存在 RNA 拖尾在电泳条带的后面 原因可能是 DNA 样品浓度太高 出现非特异性扩增 这种情况可以通过稀释模板来解决 样品 DNA 本身不纯 蛋白杂质阻碍 DNA 的泳动 3 Mark 跑的条带效果较差可能的原因有 Mark 加的量较少 琼脂糖胶做的效果不是太好 核酸染料加的较少 4 PCR 产物不是太亮的问题可能是 加样时上样较少 制胶时添加的核酸染料较少 六 实验小结六 实验小结 6 16 1 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 缓冲系统 在没有离子存在时 电导率最小 DNA 不迁移 或迁移极慢 高离子强度的缓 冲液中 电导很高并产热 可能导致 DNA 变性 因此应注意缓冲液的使用是否正 确 长时间高压电泳时 常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循