酵母SOD分离纯化及其酶学性质的研究

收稿日期 2004 6 16 作者简介 苏昕 1966 女 汉族 辽宁沈阳人 讲师 硕士 主要从事微生物与生化药学研究 Tel 024 23843711 3513 E mailsuxin660511 文章编号 1006 2858 2005 01 0067 04 酵母 SOD 分离纯化及其酶学性质的研究 苏 昕 阎浩林 梁丽莉 沈阳药科大学制药工程学院 辽宁沈阳 110016 摘要 目的发酵培养 Y12 酵母菌分离制备酵母 SOD 并研究其部分酶学性质 方法用已筛选出 的 一株 Y12 酵母菌对其在优化培养条件下发酵培养得到湿菌体 破壁抽提得 SOD 粗酶液 采用 硫铵 盐析 丙酮沉淀 Sephadex G 100 凝胶过滤和 QAE Sephadex A 50 离子交换柱层析 分离得 到酵母 SOD 并测定其部分酶学性质 结果 Y12 酵母菌 SOD 产量达 1 263 u g 1 湿菌体 分离得到酵 母 SOD 该酶属 Cu Zn SOD 比活力为 1 07315 u mg 1 活力回收率为 5411 紫外吸收峰在 25712 nm 分子质量为 32 456 u 亚基分子质量为 16 227 u 结论此酵母 SOD 与文献中报道的 动 物血红细胞 Cu Zn SOD 基本相近 关键词 酵母 SOD 分离纯化 酶学性质 中图分类号 Q 554 文献标识码 A 超氧化物歧化酶 superoxide dismutase SOD 是一种含有铜 锌 铁 锰的新型金属酶 1969 年 由 Mccord 和 Fridovich 发现其能够催化超氧阴离 子自由基发生歧化反应而命名 1 SOD 是机体 内的唯一以超氧阴离子为底物的酶 能维持细胞 内氧自由基处于无害低水平状态 是进行需氧代 谢的生物维持生存所必需的酶 由于 SOD 广泛 存在于生物界 能专一清除超氧阴离子自由基 已 引起国内外生化界和医药界的极大关注 近年 来 国外利用微生物发酵生产 SOD 的相关报道很 多 2 其中发酵法生产 SOD 是一条经济可行的 途经 3 酵母菌作为生产 SOD 的材料来源之一 具有繁殖快 代谢时间短 产率高 易培养 易大规 模工业化生产 不受季节与自然条件的限制等优 点 故作者以酵母菌作为实验材料 探索出一种 发酵法制备 SOD 的途径 为今后生产奠定必要的 技术基础 1 材料与仪器 111 菌种 酵母 Y12 本实验组经粗筛得到的高产菌株 中国科学院沈阳生态所微生物菌种保藏室提供 112 培养基 斜面培养基 8bBe 麦芽汁琼脂培养基 优化 培养基 液体种子及发酵用 酵母膏 1 g 蔗糖 2 g 酒石酸铵 2 g Fe3 0101 mol L 1 1 mL 8b Be 麦芽汁 5 mL 溶于 100 mL 蒸馏水中 调 pH 值 为 5 115e 灭菌 20 min 113 药品 邻苯三酚 分析纯 浙江省温州市瓯海精细化 工公司 QAE Sephadex A 50 瑞典 Pharmacia 进 口分装 上海化学试剂采购供应站试剂厂 Sephdex G 100 瑞典 Pharmacia 进口分装 牛血 清白蛋白 上海丽珠东风生物技术有限公司 低 分子质量标准蛋白质 分子质量 14 400 97 400 u 中国科学院上海生物化学研究所监 制 标准 SOD 酶 3 000 units 美国 Sigma 公司 其他试剂均为分析纯 114 仪器 PHS 2B 型数字酸度计 上海雷磁仪器厂 HZQ CHYA 恒温摇瓶机 哈尔滨市东联电子技 术开发有限公司 UV 9100 紫外可见分光光度 计 北京瑞利分析仪器公司 DYY 2 稳压稳 流电泳仪 配有垂直板型电泳槽 北京市六一仪器 厂 GL 16G 冷冻离心机 上海安亭科学仪 器厂 2 方法与结果 211 菌种部分 菌种酵母 Y12 经斜面培养基活化 2 次 每次 培养 48 h 转入优化种子液体培养基中培养 15 h 再转入发酵培养基中培养 15 h 温度均为 28e 第 22 卷第 1 期 2 0 0 5 年 1 月 沈 阳 药 科 大 学 学 报 Journal of Shenyang Pharmaceutical University Vol122 No11 Jan 2005 p167 对发酵液离心 4 000 r min 1 20 min 得湿菌体 水洗 2 次后称量 得到湿菌体量为每瓶 30 mL 发 酵液 115 g 菌体经超声波法破壁得粗酶液 4 酶 活力为 1 26310 u g 1 湿菌体 212 Y12 酵母 SOD 酶的分离纯化 由 2110 条的粗酶液经硫胺盐析 017 倍饱和 度 12 000 r min 1 离心 10 min 丙酮沉淀 018 倍丙酮 12 000 r min 1 离心 10 min 得 SOD 样 品 用 5 mL 蒸馏水溶解后 经 Sephadex G 100 凝 胶过滤柱层析 层析柱 116 cm 90 cm 洗脱 液 蒸馏水 流速 0125 mL min 1 每管 3 mL 整个柱层析实验在低温实验室中操作 经对收集 的每管进行酶活力测定 5 酶活力单位定义 在 1 mL 反应液中 将每分钟抑制邻苯三酚自氧化速 率达 50 的酶量 定为一个酶活力单位 即 325 nm 01030 OD min 1 为一个活力单位 及蛋白含量测 定 6 标准蛋白质为牛血清白蛋白 结果见图 1 收集酶活较高的 8 11 管共 12 mL 经真空干 燥浓缩至 5 mL 进行 QAE Sephadex A 50 离子交 换柱层析 层析柱 210 cm 30 cm 流速 30 mL h 1 每管 4 mL 洗脱结果见图 2 由图 2 洗脱曲线可知得到一个 SOD 洗脱峰 收集此峰处样品进行部分酶学性质测定 u OD 280 nm s SOD activity Fig 1 Gel filtration of SOD on Sephadex G 100 u OD 280 nm s SOD activity Fig 2 Column chromatography of SOD on QAE sephadex A 50 总结 Y12 酵母 SOD 分离纯化实验数据 结果 见表 1 Table 1 The purification of SOD from yeast Stepm total protein mgm total activity uSpecific activity u mg 1 Recovery Purificationfold Extract 7410 9 530 12818 100 1 NH4 2SO44410 8 824 20016 9216 116 Acetone 1415 7 784 53618 8117 412 Sephadex G 100 814 6 272 74616 6518 518 QAE Sephadex A 50 418 5 153 1 07315 5411 813 表 1 数据表明 分离纯化需 4 步 所得酵母 SOD 比活力为 1 07315 u mg 1 总活力回收率为 5411 此试验经五次重复 此结果是其中较好的 一次 其他结果与之相比均在 15 可信度范围 内 213 Y12 酵母 SOD 部分酶学性质测定 21311 酵母 SOD 纯度的测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯化后酵母 SOD 的纯度 以标准 SOD 酶作参照 6 分离胶质量 浓度 150 g L 1 电泳缓冲液为 pH813 的 Tris 甘 氨酸缓冲液 电泳图谱见图 3 如图 3 所示 用同一种缓冲液即 pH 715 mol L 1 磷酸钾缓冲液处理样品 在同一电泳 条件下 酵母 SOD 的电泳区带与标准 Cu Zn SOD 在同一迁移位置 初步达到电泳纯 因其电 泳区带与标准 Cu Zn SOD 基本一致 初步判定酵 母 SOD 亦为 Cu Zn SOD 21312 酵母 SOD 分子质量的测定 十二烷基硫酸钠 sodium dodecyl sulfate SDS 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳测酵母 SOD 分 子质量 6 分离胶质量浓度为 150 g L 1 电泳 缓冲液在 213110 条的缓冲液中加入 SDS 标准 Marker 蛋白 电泳图谱见图 4 由图 4 可见 酵母 SOD 在 SDS PAGE 图中呈 单一条带 可用标准蛋白测其分子质量 结果见 表 2 68 沈 阳 药 科 大 学 学 报第 22 卷 3 4 Standard Cu Zn SOD Sigma 1 2 Purified SOD from yeast Fig 3 Polyacrylamide gel electrophoresis of SOD 1 2 3 Marker protein 4 5 6 SOD from yeast Fig 4 SDS polyacrylamide gel electrophoresis of SOD Table 2 The result of molecular mass by SDS PAGE No1Marker proteinm u lgmRf Rabbit Phosphorylase B 97 400 41989 01029 012 710 Bovine serum albumin 66 200 41821 01157 111 710 Rabbit actin 43 000 41634 01357 215 710 Bovine carbonic anhydrase 31 000 41491 01657 416 710 Trypsin Inhibitor 20 100 41301 01857 610 710 Chicken egg albumin Lysozyme 14 400 41158 01986 619 710 由表 2 数据回归得标准曲线方程为 Rf 11224 5 lgm 61097 6 相关系数 r 01992 0 提 示结果可靠 将样品 Rf 616 710 01943 代入回归 方程 算出样品亚基分子质量为 16 227 u 因 Cu Zn SOD 由两个相同的亚基组成 7 8 则此酵母 SOD 的分子质量为 32 456 u 21313 酵母 SOD 的紫外吸收光谱测定 将纯化后的酵母 SOD 用 pH715 的 011 mol L 1 磷酸缓冲液处理 以相同缓冲液作为 空白对照 在 200 400 nm 紫外光下进行连续 扫描 测定酶的最大吸收波长 所得图谱见图 5 Fig 5 UV Spectrophotography of Yeast SOD 由图 5 可见 Y12 酵母 SOD 最大紫外吸收波 长为 25712 nm 相关文献中报道 牛血 Cu Zn SOD 为 258 nm 大豆 Cu Zn SOD 为 26514 nm 鸭红细胞 Cu Zn SOD 为 258 nm 7 8 一般蛋白 质最大紫外吸收波长应在 280 nm 左右 由于 SOD 酶蛋白分子中不含色氨酸 酪氨酸含量也极 低 最大紫外吸收在 260 nm 左右是各种来源的 Cu Zn SOD 的共同特征 3 结论 a1 作者对酵母 SOD 酶的 4 步分离纯化 得到 相对较纯的 SOD 酶液 比活力为 1 07315 u mg 1 总活力回收率为 5411 b1 对纯化后的 Y12 酵母 SOD 样品进行部分 酶学性质测定 结果此酵母 SOD 分子质量为 32 456 u 亚基分子质量为 16 227 u 与文献报道 的动物血中 Cu Zn SOD 相近 8 其紫外最大吸 收峰在 25712 nm 这也是各种来源的 Cu Zn SOD 的典型特征 参考文献 1 Weisiger R A Fridovich I Superoxide dismutase J Biol Chem 1973 218 3582 3592 2 张尔贤 SOD 应用技术国外研究动态 J 药物生物 技术 1995 2 2 51 57 3 崔慧斐 张天民 超氧化物歧化酶在食品和化妆品中 的应用及其发酵法生产进展 J 药物生物技术 2000 7 3 187 189 4 修志龙 姜伟 苏志国 细胞破碎技术的研究进展和 发展方向 J 化工进展 1994 1 15 21 5 邹国林 桂兴芬 一种 SOD 的测活方法 邻苯三酚自 氧化法的改进 J 生物化学与生物物理进展 1986 69 第 1 期苏 昕等 酵母 SOD 分离纯化及其酶学性质的研究 4 71 73 6 张龙翔 张庭芳 李令媛 生化实验方法和技术 M 第 2 版 北京 高等教育出版社 1997 97 100 100 106 137 138 140 142 7 方林求 王立明 吴魁 大豆超氧化物歧化酶的分离 与鉴定 J 中国生化药物杂志 1996 17 2 65 67 8 余瑞元 王楠 徐长法 北京鸭红细胞超氧化物歧化 酶的分离纯化和性质 J 北京大学学报 自然科学 版 1990 26 4 457 481 Purification of the SOD from the yeast and studies on its enzymology character SU Xin YAN Hao lin LIANG Li li School of Pharmaceutical Engineering Shenyang Pharmaceutical University Shenyang 110016 China Abstract ObjectiveTo purify SOD from yeast Y12by fermentation and study on its enzymic character MethodsIn this experiment the SOD producing strain yeast Y12was obtained from 9 strains of different yeasts Its wet weight of cells and production of SOD were all higher under optimal conditions The SOD from yeast Y12by fermentation has been purified by salting out with ammonium sulfate fractionation ace tone precipitation sephadexG 100 gel filtration and column chromatograph on QAE sephadexA 50 Results The specific activity of SOD from yeast was estimated as 107315 u mg 1 the yield of the activity was 5411 molecular mass was 32 456 u and the molecular mass of enzyme subunit was 16 227 u It exhibits one absoration maximum in the ultraviolet at 257 nm ConclusionsThe results indicate the enzyme is Cu Zn SOD This enzyme is similar to the Cu Zn SOD from animal blood erythrocyte in characterization Key words SOD yeast purification enzymology characterization 上接第 61 页 Effects of mistletoe lectins on tumour cells cell cycle FU Wei xin1 LIANG Zai fu2 LI Tie ying2 SUO De tai3 1 The Clinical Laboratory Department The General Hospital of the Shenyang Militory Region Shenyang 110016 China 2 The Centered Laboratory Chian Medical University Shenyang 110001 China 3 The Hospital ShenyangPharmaceutical University Shenyang