EBV与细胞永生化

,EBV与细胞永生化,20.1 概述20.2 EBV基本结构及其表达产物 20.2.1 基本结构 20.2.2 表达产物20.3 EBV感染和复制 20.3.1 感染 20.3.2 EBV转化外周血B细胞20.4 EBV对B细胞的生长转化作用 20.4.1 对B细胞的激活和转化作用 20.4.2 与转化功能有关的病毒基因 20.4.3 LCLs与细胞永生化机制研究 20.4.3.1 LCLs与 p53及细胞周期调控相关基因 20.4.3.2 LCLs与端粒酶活性 20.4.3.3 LCLs与异常核型20.5 EB病毒和人类肿瘤20.6 展望,20.1 概述 Epstein-Barr病毒(EB病毒)是疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员其感染十分普遍在发达国家,EBV的感染多发生于青春期,易引起传染性单核细胞增多症(IM);而在发展中国家,EBV的感染通常发生在5岁之前,多为亚临床感染,成人的感染率高达98%,病毒可携带终身EBV之所以引起全世界的广泛关注,不仅因为EB病毒是IM的病原,而是由于EB病毒参与了人类多种恶性肿瘤的形成,包括Burkitts淋巴瘤(BL)鼻烟癌(NPC)免疫耐受个体的B淋巴细胞瘤及何杰金氏病(HD)非 Hodgkin性 T细胞淋巴瘤(NHL)胃癌乳腺癌肝细胞癌和免疫缺陷患者发生的平滑肌细胞瘤等可能与 EBV感染相关,50年代末期,Burkitt发现儿童淋巴瘤的区域分布等特点,提出了其致病因子可能为病毒的假说经过数年的努力,Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株,并在建株细胞涂片中用电镜观察到了疱疹病毒颗粒,从而发现了EB病毒Old等在1966年用免疫扩散法揭示了EB病毒和鼻咽癌的血清学关系70年代初,Henle夫妇建立起最初的EB病毒血清学检查方法,为EB病毒的检测提供了重要的手段,并进而证实了本病毒是传染性单核细胞增多症的病原体进入80年代,分子病毒学的发展使EB病毒的研究进入了新的层次随着其基因组测序的完成,以及蛋白质组学的飞速发展,多基因产物的鉴定和分析,对EB病毒的相关基因和蛋白质有了初步的了解,EB病毒的形态理化性状及生物学特性都和疱疹病毒科的其他成员有类似之处,能和它们一样在感染机体后,建立起长期的潜伏感染EBV还有一个与其他 DNA病毒不同的特点,就是它具有在体内,以及体外感染人及某些灵长类B细胞的专一性,并能刺激受感染细胞持续性生长并引起细胞无限期传代达到”永生”,从而形成淋巴母细胞样细胞系 (lymphoblastoid cell lines,LCLs)由于肿瘤与EBV的确切关系极为复杂且存在争议,而LCLs没有肿瘤形成过程中的复杂因素,使其成为了研究 EBV介导的细胞永生的最佳模型,20.2 基本结构及其表达产物,(1)形态结构和理化特性 成熟的EB病毒颗粒为直径180nm的球形其基本结构可分为核样物核衣壳和包膜三部分,20.2.1基本结构,(2)病毒基因组的结构 80年代初,EB病毒的基因组即已被分段克隆1983年,Barr等完成了对其整个基因组的序列测定1)大体结构 EB病毒基因组的大体结构可分为如下几个部分(图1)：末端重复序列(TR);内重复序列(IR)DL和DR 在不同的病毒株具有以上重复序列的个数不一,这一特点可被用于不同病毒株的鉴别和确定有无两种病毒株的双重感染。,2)病毒基因组序列 EB病毒基因组在疱疹病毒科成员中最早被全部测序,所用的病毒株是用枭猴B细胞经病毒转化后获得的B958,它亦是最为广泛使用的实验EB病毒株本病毒的核酸序列主要特征为:总长度为172 282bp(B958株有一段约10kb的缺失区,据此估计野生型的长度应在185kb左右);根据序列测定结果分析,可确定有约80个ORF后者的命名方式见（图1）与疱疹病毒科其他成员的序列比较显示出明显进化上的联系尽管总的序列同源性很低,但在基因组的不少区域,不仅功能相同的基因之间有同源性,而且整个区域内的基因排列也极其相似病毒基因组成至少携有2个和人细胞基因同源性很高的基因。,3)病毒分型 EB病毒分为两个亚型,A型和B型,亚型之间存在明显差异:从基因结构上看,在EB病毒的一些基因组中(如EBNA-2,EBNA-3A,EBNA-3B,EBNA-3C和EBERs)存在碱基对的缺失或/和插入蛋白水平上的差异,如上述的编码基因的差异必然导致相应蛋白的结构差异不同的蛋白结构引起不同的抗原抗体反应,因而用血清学方法可间接区分开A型和B型EB病毒感染在生物学上,B型EB病毒转化B淋巴细胞的能力较A型弱,因此建立B型EB病毒细胞株较困难从地区分布上看,A型遍布全球,B型多集中在非洲中部一带从EB病毒相关疾病看,A型感染的疾病较广,B型则集中在部分非洲的Burkitt淋巴瘤部分人体免疫缺陷病毒(HIV)阳性淋巴瘤和爱斯基摩人鼻咽癌中,20.2.2 表达产物,EBV基因结构中有84个开放读码结构(ORF),包括100多个基因,但只有9个基因能在体外感染转化的B细胞中表达蛋白质这9个基因能编码6个EBV核抗原(EBNArb)和3个潜在膜蛋白(LMP13),其在细胞增生转化过程中作用不相同,以EBNA1EBNA2EBNA-LP和LMP1作用更加重要,20.2.2.1 潜伏期的基因表达,1)核抗原家族(EBNA) 是一组核蛋白,目前共检出6种他们都有共同的转录启动子和5端,然而它们的主要编码区则由于不同的转录剪切而完全不同,由此而产生完全不同的核抗原核抗原往往携带不同数量的重复片断,因而其Mr可以有较大的差异,EBNA1:EBNA1是一种序列特异性 DNA结合磷蛋白, 由BKPF1编码可分为四部分:由89个氨基酸组成的N端,富有碱性残基;由多个”甘氨酸和丙氨酸”所组成的重复序列,长度约250个氨基酸；主要由碱性残基组成的短区域;一较长的主要由酸性或碱性氨基酸组成的C端EBNA1在所有 EBV感染的细胞中唯一始终表达的蛋白质它对于具有回文结构的同源序列 (TAGGATAGCATATGCTACCCAGATCCAG)具有很强的亲和性,与同源序列结合后可以诱导病毒基因组游离体的复制启动多个潜伏感染期病毒基因的转录,并能调节宿主细胞基因的转录有研究证实 EBNA1缺失的重组病毒会丧失使 B细胞永生化的能力EBNA1的核心部分的 Gly-Ala重复序列,是主要组织相容性复合体 I型限制性递呈的顺式抑制因子,它能阻抑蛋白酶体对蛋白质的加工过程,影响抗原多肽的产生,从而防止EBV感染的细胞被细胞毒性 T细胞杀伤,EBNA2:EBNA2是一种Mr为(7890)X103,富含脯氨酸的核蛋白有2个功能区,位于450464残基间和425252残基间,前者为酸性反式活化区域,后者是EB-MA2反应元件(E2RE)活化区域,是生长和转化E2RE的功能区,能与细胞结合蛋白结合。所以EBNA2是通过与细胞结合蛋白结合,通过该蛋白与E2RE结合而E2RE又位于LMP1LMP2CD23基因上游,随着EBNA2的表达,CD21CD23LMP1LMP2的基因表达也增强,EBNA2在EBV潜伏感染和细胞转化中起反式激活剂的作用EBNA2基因以及 EBNA-LP基因的最后两个外显子缺失的突变的 EBV病毒株P3HR1不能使 B细胞永生化;而将从 B95-8病毒株获得的 EBNA2基因和 EBNA-LP基因导入P3 HRl基因组就会使其获得完全的永生化能力EBNA2是一转录激活因子,实验结果显示其转录激活功能和转化功能不可分割,表明后者很可能是通过前者来实现的,EBNA-LP(EBNA-5):EBNA-LP由每一种EBNA m RNAs的前导序列编码,分子遗传学研究表明,虽然 EBNA-LP并不是体外 B细胞转化所必需的,但它却是 LCLs的高效生长所需要的EBNA-LP和 EBNA2瞬时感染初级 B细胞会引起细胞由 G0 期向 G1 期的转化,表现为细胞周期蛋白D2表达的上调EBNA-LP与p Rb和 p53都存在相互作用,有 EBNA-LP基因缺失的病毒永生化 B细胞的能力会降低,EBNA3A,EBNA3B(EBNA-4), EBNA 3C(EBNA-6): EBNA3A,EBNA3B和EBNA3C是由有着共同起源的三个基因在 Cp或Wp启动子的作用下转录并翻译出来的三种亲水性核蛋白EBNA3家族的成员都是转录调节因子,能抑制或者激活转录;它们可以通过抑制 RBP-J蛋白与 DNA的结合间接性的抑制 EBNA2介导的TP1和 LMP1启动子的激活过程对 EBV重组体的研究表明,EBNA3 A和 EBNA3 C对于 B细胞的体外转化是必需的,其中 EBNA3 C能够使细胞基因 (CD2 1 )和病毒基因 (LMP1 )的表达上调抑制启动子 Cp与视网膜母细胞瘤蛋白 (p Rb)相互作用而促进转化EBNA3 B虽然不是转化所必需的,但它能诱导波形蛋白和 CD40的表达,2)潜伏期膜蛋白家族(LMP) ：有LMPl和LMP2两种,其中的LMP2又由于其5端起始区的不同而分为LMP2A和LMP2B两种 LMP1：LMP1是一种386个氨基酸组成的典型膜结合蛋白BNLFl编码的LMP1由一个亲水性 N-末端胞质区一个长200个氨基酸残基的C-末端胞质区和6个跨膜区组成N端部分是使LMP1分子固著于膜上,在膜上呈点片状分布所必需的在维持B细胞激活转化及免疫调节上起一定作用实验表明 ,将N端编码Arg及Pro2种氨基酸残基的DNA区删除 ,则使突变子对B细胞转化能力降低C端末端区含有2个使NF-B活化的小区,CTAR-1(C-terminal activation region)和CTAR-2进膜区的CTAR-1能直接与肿瘤坏死因子(TNF)受体信号相关因子的TRAF蛋白结合,从而激活NF-B的活性,激活细胞增生CTAR-2并不直接与TRAF结合,而是通过与蛋白受体相关致死功能蛋白(TRADD)结合后,与TRAF3形成复合体从而激活NF-B,由于LMP1位于细胞膜上 ,从而推测它在细胞间信号的传递过程中起到重要作用 ,也是它发挥重要的生物学功能的物质基础和结构基础近年来对LMP1的生物学功能进行了大量的研究研究表明 ,LMP1能使鼠类成纤维细胞株发生转化 ,主要表现在细胞形态改变细胞间接触抑制丧失等 ,证明LMP1与细胞的转化增殖以及去分化有关在EB病毒转化B细胞的研究中发现 ,LMP1具有促进及维持B细胞转化及永生化的重要作用 ,能引起B细胞标志CD40CD2 3及CD54等的表达增加 ,使CD10的表达减少 ,能引起细胞粘附分子LFA1LFA3及ICAM-1的表达受到激活进一步研究发现 ,LMP1在细胞中基因转录过程中具有重要作用它能诱导NF-kB核转录因子的表达活化, NF-B进而激活A20基因的表达,产物能拮抗TNF-a细胞毒作用LMP1还能跨域激活某些病毒的启动子 ,如HPV启动子HIV-1LTR的启动子人类T细胞白血病型病毒 (HTLV-1 )的启动子受到诱导表达这是由于LMP1能选择性地修饰抑制分子IkBa ,通过使其失活而消除IkBa对NF-B的抑制作用 ,并使NF-B活化表达 ,进而使病毒启动子的表达得以活化,bcl-2是从滤泡性淋巴细胞瘤中分离出来的 1种癌基因 ,其表达产物是具有抗程序性细胞死亡的 1种膜结合蛋白 ,随着bcl-2表达的增加 ,细胞存活期将延长 ,细胞不断增殖 ,进而促使肿瘤形成在体外培养细胞的研究中发现 ,LMP1能诱导bcl-2基因的表达 ,并且还能上调抑瘤基因 p53的表达但在近年来的研究中发现 ,LMP1在人的上皮细胞株 (RHEK-1 )引起的细胞转化 ,并不伴有bcl-2基因的表达 ,表明在参与致上皮癌变的过程中 ,LMP1所起的作用是复杂的 ,可能不同于它在B细胞或成纤维母细胞中的转化作用,LMP2 LMP2是一种亲水性膜蛋白,由于起始转录的启动子不同而形成两种不同的表达产物LMP2A和LMP2B,两者只有一个外显子不同,有研究表明LMP2B是LMP2A的负调控因子LMP2A和LMP2B都以小斑块的形式存在于LCLs的质膜上并参与细胞的信号传递途径,但都不是 B细胞转化所必需的LMP2A的N-末端区包含8个酪氨酸残基,其中的两个构成了以免疫受体酪氨酸为基础的激活基元 ITAMLMP2A能通过磷酸化的ITAM与 PTKs(蛋白酪氨酸激酶)相互作用,对PTKs的活性进行负调控,20.2.2.2即刻早期基因的表达,这是一组在病毒基因组从潜伏状态被活化后最早表达的一组蛋白,其产生不依赖于其他病毒蛋白的新合成目前所知的:主要有BZIF1和BRLFl两种蛋白,20.3 感染和复制,20.3.1感染 (1)B细胞 EB病毒在体外唯一能感染的细胞是人类和部分灵长类的成熟B细胞一般认为这是因为EB病毒的受体限于在该细胞上表达EB病毒受体是称为CR2或CD21的糖蛋白,Mr为14X104这个由细胞编码的蛋白同时亦是补体成分C3d的受体EB病毒通过膜糖蛋白gp320/220和CR2相附着上皮细胞表面也找到了EB病毒受体,其序列和B细胞的EB病毒受体相差无几然而上皮细胞在体外却对EB病毒不易感,可能EB病毒进入细胞还需要另外的B细胞特有的因子参与在体内,EB病毒的主要靶细胞,是成熟的B细胞,尤其是处于静止状态的成熟B细胞,因为在这些细胞的表面,病毒受体分布最为致密,(2)感染过程 病毒体首先通过gp320/220吸附到携有CR2分子的B细胞上,随后通过细胞内吞作用进入光滑内质网,病毒包膜与后者融合后,将核衣壳释入细胞质可能由细胞微管系统导入细胞核内,脱壳后,线状的病毒DNA由细胞蛋白使之环化,并可能在细胞转录因子的作用下,进入病毒周期 EBV感染上皮细胞的机制较为复杂 ,可能有以下几种方式 :上皮细胞与EBV阳性的 B淋巴细胞紧密接触 ,引起上皮细胞的感染 ;VCA/ p Ig A抗体介导 EBV感染人粘膜上皮细胞 ;EBV通过 CD2 1依赖性方式感染 CD2 1分子阳性的上皮细胞 ;EBV通过其它辅助受体感染上皮细胞 ；EBV包膜糖蛋白复合体 g H-g L参与 EBV对上皮细胞的感染至于 EBV是否尚存在其它方式进入上皮细胞值得进一步研究证实,Figure 1. Model of EpsteinBarr Virus (EBV) Infection in Humans. In the oropharynx, EBV directly infects resting B cells or infects epithelial cells, which in turn infect B cells. During primary infection, EBV-infected B cells undergo lytic infection with production of virus or express the full complement of latent viral proteins. The latter cells are kept in check by natural killer cells and cytotoxic T cells. After convalescence, EBV is present in the peripheral blood in latently infected memory B cells that express latent membrane protein (LMP) 2 and possibly EBV nuclear antigen (EBNA) 1. The latter cells can undergo EBV reactivation and express other latent viral proteins, resulting in their recognition and destruction by cytotoxic T cells. Some latently infected cells undergo lytic replication in the oropharynx, resulting in production of virus with shedding of virus into the saliva or infection of epithelial cells with release of virus. Adapted from Cohen with the permission of the publisher.19,(3)病毒周期 EB病毒进入B细胞后,通常很快进入潜伏期病毒基因组持续存在于细胞内仅有很少量的病毒蛋白得以表达,无病毒DNA的增殖期复制;但病毒在受染细胞群中的少数细胞可以进入增殖期,并产生病毒颗粒个典型的病毒周期。在体外建株的类淋巴细胞或类淋巴母细胞,携有进入增殖期病毒的细胞占细胞总数的1%一5%使用某些EB病毒活化剂可以增加携带进入增殖期病毒的细胞数量,使之达到60%左右假如同时使用EB病毒活化剂和病毒DNA聚合酶抑制剂,可把病毒周期控制在病毒早期,这是研究早期蛋白的一个重要手段,(4)病毒在体内的潜伏 EB病毒进入人体后便建立起持续性的潜伏感染在一定因素的作用下,亦可被激活其表现为:外周血中持续存在能于体外培养传代的EB病毒阳性B细胞,持续高效价的抗EB病毒抗体(尤其是IgG);周期性的唾液内携带病毒然而迄今,在人体内潜伏感染的病毒究竟在何处潜伏,尚无定论较为有影响的两种假设为:一种认为是在鼻咽部:皮细胞(尤其是粘膜基底部),而另一种则认为是血液的B细胞,20.3.2 EBV转化外周血B细胞,1)的制备: 用含 1 0 %小牛血清1 640生长培养95-8细胞至一定密度,最后一次换液后33,714培养。用1500/离心15,留上清液 , 0 .45滤膜过滤 ,-70保存。 2）外周抗凝血 2与1640培养基 11混合 ,逐滴至盛淋巴细胞分离液的试管内 ,静止 ,2000r/离心20 ,待外周血分成四层 ,吸取白细胞层 ,用 1 640培养基洗涤 2次 ,加含 2 0 %小牛血清 1 640培养基 (含环孢霉素 0.2 /)至 2 4孔板内 ,另加 1 0 0 ,混匀 ,在 3 7 5%2 培养箱培养 ,第 5天左右半量换液 ,1 0 1 2即可看到 2 4孔板内有形态呈梭型的类似成纤维细胞的贴壁细胞 ,这种细胞即为刚转化的类淋巴母细胞 ,培养 2 0左右可看到形态似玫瑰花花瓣的转化细胞 ,连续培养就成为典型的转化淋巴细胞株。,20.4 对B细胞的生长转化作用,正常的人类细胞在体外培养过程中会表现出有限的增殖潜力,而且其寿命随着供体年龄的增加而缩短但 EBV可在体外感染静止状态的正常 B淋巴细胞,使大约 1 0 %的细胞转变成为可以持续传代的永生化的B细胞系,即 LCLs利用可以控制某种病毒基因表达开关的条件体系进行的研究证明,B细胞的不断增殖严格的依赖于病毒基因的表达,所以B细胞的永生化是一种可逆转的现象,这与通常的肿瘤细胞不同,肿瘤细胞多以不可逆的遗传异常的积累为特征所以,用“永生化”而不是“转化”来描述 EBV感染 B细胞后瞬时作用的结果更为确切一些LCLs具有肿瘤细胞永生的特性,却没有肿瘤细胞发生的复杂背景,所以成为了深入研究细胞永生化机制的一个良好模型一般认为,EBV是通过病毒蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径而使细胞永生化的,但是病毒蛋白的具体作用机制尚无定论,所以研究往往从寻找 LCLs不同于静止期 B细胞的特点开始着手,20.4.1 对B细胞的激活和转化作用,EB病毒一旦附着于B细胞表面,即可引起后者激活,并产生一系列的生物效应:受染细胞从细胞周期的G0进入G1期,还伴有细胞编码的B细胞活化抗原(诸如CD23和白细胞移动抑制因子等)的合成和释放这种由病毒附着所引起的初期激活作用产生迅速,且用在体外被灭活的病毒颗粒也可产生同样效应 在初期激活作用的基础上,随着病毒颗粒穿入细胞内以之起潜伏感染,细胞的活化进一步加剧,引起细胞的RNA合成抗体分泌DNA复制和细胞分裂EB病毒引起的细胞活化和通常在体外使用的B细胞活化剂引起的细胞活化不同,其区别在于后者只起一种暂时的作用,而EB病毒引起的细胞活化则导致细胞无休止地增生,转化为永生的类淋巴母细胞株EB病毒感染建株的类淋巴母细胞尽管是永生细胞,但接种裸鼠皮下后,并不产生肿瘤,这是此类细胞与大多数直接从BL组织中建株的类淋巴细胞在生物学特性上的主要区别,20.4.2 与转化功能有关的病毒基因,寻找与 EB病毒细胞转化功能有关的基因,主要依靠病毒遗传重组实验的途径随着实验技术的发展,这方面的研究经历了3个阶段的发展:回复突变重组:病毒株P3HRl产生的病毒颗粒无转化细胞能力,对其基因组的分析发现NA2区域有较大缺失:将该病毒株和该区域基因组完整的其他病毒株重组,得到的具有转化能力的重组株一概具有完整的NA2基因此后用单个NA2基因和P3HR1重组,亦成功获得了能转化细胞的回复突变株,由此进一步证实了NA2在转化细胞中的重要作用它亦是第1个被实验方法确认的转化细胞的必需基因定向基因缺失突变株：该方法利用同源重组的原理,将一选择基因(如新霉素耐药基因)取代病毒基因组的某一特定基因(靶基因),经筛选后便得到定向基因突变株Kieff和Sugden分别领导的两个实验室在这方面作了大量工作,先后确定了6个NA中的5个(即除NA5之外),和膜抗原1为6个转化功能的必需基因建立“微型”EB病毒:为了证实其他病毒基因的存在与否并不影响病毒的细胞转化功能及研究6个转比必需基因的相互关系,Kieff的实验室成功地用由3个噬菌体携带的病毒基因组片段重组成具有转化细胞能力的Mini EB病毒综合上述实验,EB病毒基因组与细胞转化有关的片段总长度为64kb,20.4.3 LCLs与细胞永生化机制研究,目前这方面的研究尚处于起步阶段,但正日益受到重视总之概括起来,有以下三方面的研究20.4.3.1 LCLs与 p53及细胞周期调控相关基因20.4.3.2 LCLs与端粒酶活性20.4.3.3 LCLs与异常核型,20.4.3.1 LCLs与 p53及细胞周期调控相关基因,众所周知,p53作为一种抑癌基因,能够阻滞细胞周期的G1/G0 期,使细胞不能进入 S期,从而抑制细胞无限制的分裂增殖,诱导那些DNA损伤的细胞发生凋亡在EBV使B淋巴细胞永生化形成LCLs的过程中,病毒对于细胞分裂和凋亡的永久性调控是必需的,而这种功能在许多正常细胞中是由 p53执行的,所以人们开始关注EBV感染和转化的早期阶段 EBV基因和 p53之间的关系有趣的是,Chen等经试验证明,EBV感染静止期B细胞后提高了细胞p53的转录水平这种p53水平的提高大约始于感染后2 4小时,这一时间比EBV诱导的细胞DNA合成至少早 2 4小时; p53水平在感染后4 5天达到最高 (大约是静止期 B细胞的 1 0倍 );此后,缓慢的降低,然后保持某一水平至少 5个月EBV能够克服正常的细胞调控机制而导致细胞的永生化生长,阻止细胞的正常死亡,而这些调控机制中的一些是 p53依赖性的研究表明,p53的诱导并不是通过EBV结合于细胞表面的CD2 1而触发的细胞内信号传递途径完成的p53水平提高的时间提示EBNA2和LMP1可能与此过程有关,因EBNA2在EBV感染后12 24小时开始可以检测到,而LMP1水平的峰值出现于感染后4 6 天。,事实也的确如此,有试验证明,EBNA2和LMP1分别通过激活转录因子NF-B独立的介导了EBV感染后细胞内p53水平的增高但为什么p53的表达水平上调了细胞还会永生化呢? Chen认为原因可能有以下几个方面: p53可能要达到一个阈值才起作用,而EBV感染期间没有达到此阈值; p53介导的细胞周期中断或细胞凋亡的下游事件可能被 EBV潜伏蛋白或EBV诱导的细胞蛋白所阻断; EBV诱导的c-myc和其他细胞周期调控蛋白(比如细胞周期蛋白D2,cdc-2,细胞周期蛋白E)水平的增高可能阻断了高表达的p53和p21/WAF1的抑制作用,从而不断的推动细胞跨越正常的细胞周期控制点而增殖,除了p53水平的异常之外,LCLs中还有若干基因的表达发生了变化比如cyclin D2m RNA在静止状态的初始B淋巴细胞中检测不到,但在EBV感染后的细胞中则高表达因为与 CDK4和CDK6(周期蛋白依赖性蛋白激酶)相互作用的D型细胞周期蛋白是细胞通过G1期的正调控因子,所以EBV感染的B淋巴细胞中cyclin D2的高表达可能对于细胞的增殖状态具有直接影响Martine等人研究了 EB病毒感染静止期 B淋巴细胞过程中细胞周期相关基因表达水平的变化,发现LCLs中c-myc的表达水平至少上调了10倍;而最显著的差别在于 cdc-2,cyclin E,CD23和cyclin D2的表达,一系列cDNA稀释物的比较表明,这些基因的表达在EBV感染后至少上调了100倍,20.4.3.2 LCLs与端粒酶活性,端粒 (telomere)是真核生物线性染色体末端的一种特殊的异质化结构,有防止染色体降解重排缺失断端彼此融合的作用。它随着细胞的分裂DNA末端复制依赖性重复序列 (5-TTAGGG-3)的丢失而进行性缩短,从而导致染色体不稳定,引起细胞的衰老和死亡,故被称为是”生命的时钟”而端粒酶是一种自身携带模板的反转录酶,能够在缺少 DNA模板的情况下延伸端粒寡核苷酸片断,防止端粒随细胞的分裂而逐渐缩短;还能添加端粒重复序列 5-TTAGGG-3至 DNA末端,为 TRF2提供结合位点,防止染色体末端融合,从而稳定染色体的末端大多数情况下,正常人体细胞中不能检测到端粒酶的活性,而 90 %的癌细胞则显示很高的端粒酶活性,所以人们认为端粒酶在细胞的永生化过程中起着重要的作用,其中的具体过程可以表述如下 :,端粒的数目控制着细胞的增殖能力,而端粒酶在生殖细胞中维持端粒的长度;随着细胞的发育,端粒酶的活性受到抑制,端粒持续变短,当正常人体细胞的端粒缩短至一定程度时,启动阻止细胞分裂的信号,细胞开始衰老死亡另外一些细胞由于癌基因抑癌基因等的突变逃逸 M1期,获得额外增殖的能力,进入第二死亡期 (M2期 ),此时端粒酶仍为阴性,端粒进一步缩短,大部分细胞达到极限而死亡;只有少量端粒酶重新活化的细胞获得无限增殖的能力,成为永生细胞,EBV永生化的 LCLs的一个最显著特点就是端粒酶活性的提人们一直认为 EBV-LCLs都是永生化的细胞,但 Okubo等人的研究认为,只有那些具有强端粒酶活性可以稳定端粒的细胞才会真正的永生化,比例大约为每 5 1 0 6 5 1 0 8个细胞会有一个细胞获得永生 Sugimoto等也认为”永生化”这个词只能用于描述持续增殖超过 1 6 0 PDLs的 EBV转化的 LCLs,而这些细胞通常具有比最终死亡的 LCLs强 50 1 0 0倍的端粒酶活性Okubo等人研究了 8个 EBV-LCLs在传代培养过程中端粒酶活性的变化,进一步证实 EBV-LCLs在永生化了之后,端粒酶活性会增强 50倍或更多,端粒的长度由永生化前的 6 2 0 kb缩短为 5kb以下,并保持稳定,由此可见,细胞在传代的过程中,端粒逐渐缩短,而且细胞在具有了强端粒酶活性之后于较短的端粒状态下获得稳定虽然已有大量实验证明,端粒酶活性与细胞的永生有着密切的联系,但也有一些研究报告提出了反面的证据比如,Carman等报告说,二倍体的叙利亚仓鼠胚细胞在复制分裂的各阶段始终表达端粒酶,其端粒长度亦保持稳定,但经过 2 0 3 0代的分裂后,仍然会衰老死亡;而且人们已经获得了剔除端粒酶基因的小鼠,但在其前 5代中,并未观察到相应的表型变化 (如寿命的缩短 )所以,在永生化的 LCLs细胞中,端粒酶活性的提高对于细胞的永生究竟起多大的作用 ?是始因还是永生过程中的中间结果 ?都还是有待解决的问题,20.4.3.3 LCLs与异常核型,静止期B细胞在具有强端粒酶活性而永生化后,会形成克隆化的异常核型8个 EBV-LCLs的核型研究表明,永生化的EBV-LCLs的异常核型具有如下特征:1)在一个细胞系中,异常核型克隆化;2)异常核型包括染色体易位及四倍体形成等,以染色体易位最为常见，但就目前研究来看,易位的发生并没有显著的特异性; 3)不同的细胞系会形成不同的异常核型比如,在400 DPLs以上,细胞系N0003的异常核型主要表现为46,XX,add(7)(q22),+12,der(13;14)(q10;q10),而细胞系N0005则主要表现为46,XY,add(3)(p25),add(8)(q2 4.3),del(17) (p11.2),而且,研究者还找到了一些染色体畸变的热点区1p31,1q31,2q32,3q13,6q24,7q31,强端粒酶活性常常与异常核型相伴发生,但究竟染色体重排是伴有端粒酶活性增强的永生化的原因还是其结果,仍然是未知数关于细胞衰老机制的研究一直是一个百家争鸣的课题,迄今为止已经提出了多达300多种关于衰老起因的观点或学说,比较有影响的例如:氧化性损伤学说神经免疫网络学说遗传程序学说rDNA与衰老学说端粒酶学说等等以EBV介导的LCLs为模型研究细胞的永生化机制虽然是一个很好的切入点,但目前看来这方面的研究还比较粗浅;永生的细胞究竟突破了哪些引发细胞衰老的限制性条件才逃逸了细胞正常的生长调控?这可能是一个涉及众多基因及代谢途径的复杂过程,有待于人们通过不同的研究方法,从新的视角进行多方位多层次的探讨,20.5 EB病毒与人类肿瘤,鼻咽癌儿童淋巴瘤胃癌肺癌,(1)鼻咽癌,从细胞病理角度可将鼻咽癌分为未分化低分化和高分化3种其中以未分化鼻咽癌与EB病毒感染相关性最为密切曾认为低分化和高分化鼻咽癌与EB感染无关,但近年来采用更敏感的检查技术,结果显示它们和EB病毒也有一定联系 鼻咽癌的发生具有很明显的地理分布特征我国及东南亚为该肿瘤的高发区(发病率每年达10/10万以上,在欧洲和美洲则为低发区(每年1/10万),在广东北非及阿拉斯加的爱斯基摩人群中为中等发病区(每年1l0/10万) EB病毒和未分化鼻咽癌的密切关系表现在:所有病例的癌组织中部有病毒基因组的存在和表达;病人血清中有高效价的IgG和IgA抗EB病毒抗原(主要是核衣壳及早期抗原),且这种异常的特异抗体效价的升高往往发生在临床发现肿瘤之前同一病例的癌细胞中仅有单一的非常局限的原位癌中无不例外地有病毒存在,也是病毒参加癌形成过程的早期变化的证据之一,和大多数人类肿瘤一样,鼻咽癌也与其他多种致癌因子有关,流行病学调查显示该肿瘤和高发区的居民饮食植物及水中存在的某些促癌物质(tumorpromoter)有相关性近年来亦有报道认为至少在高发人群中有遗传因素的影响,然而一般认为上述几种因素比其与EB病毒的相关性低得多。,(2)儿童淋巴瘤,肿瘤的组织病理学为小细胞样高度恶化淋巴瘤流行病学上可分为流行性和散发性两种前者主要分布在非洲赤道周围的区域,其中90%以上的病例中可检测到EB病毒的存在(面后者中只有10%20%)不管是哪一种类型,该患者B细胞中都伴有染色体易位常见的为14:8,较为少见的为22:8和2:8,分别为免疫球蛋白H链(14)x链(2)和L链(22)与位于第8染色体上的原癌基因c-myc互相易位EB病毒在儿童淋巴瘤病因中所起的作用,以及和染色体易位之间的关系至今未能确定 一般认为,EB病毒的长期体内潜伏期感染本身并不能导致染色体易位,用感染者外周血建立的B细胞永生系不具有这种改变,因而一定还有其他因素的参与,儿童淋巴瘤流行区恰好和疟疾流行区的地理分布一致,故该疾病的存在,尤其是其对人体免疫系统的持续刺激,被认为是和肿瘤相关的因素之一此外亦有人报道水土及饮食中致癌物质和该病有联系随着Burkitt淋巴瘤和先天性免疫缺陷病伴淋巴瘤被认为是EBV相关淋巴瘤后 ,近来又发现了许多EBV相关淋巴瘤的新亚型EBV相关淋巴瘤各亚型与EBV的关系程度存在差别 :Burkitt淋巴瘤先天性免疫缺陷病伴淋巴瘤和脓胸后淋巴瘤 ,大约全部病例证明与EBV相关 ;NK淋巴瘤 /白血病鼻腔原发T/NK淋巴瘤川崎氏病脂肪织炎型皮肤淋巴瘤纵隔B细胞淋巴瘤 ,EBV只在大多数病例存在 ;AILD型淋巴瘤和未分化大细胞型淋巴瘤 ,只有少数病例EBV阳性此种差别可能是由于各亚型的发生机制造成的,EBV在体外可感染B细胞 ,使之永生化 ,并建立了类淋巴母细胞株 (LCLS)在体内EBV感染的宿主细胞增殖能力很强 ,呈复数或多数细胞同时增殖EBV相关淋巴瘤的发生机制有二个假设：第一,EBV潜伏感染基因产物可致宿主细胞永生化这种机制主要发生在常见的淋巴瘤 ;第二,继发性基因异常染色体转位可引起C-myc表达亢进Burkitt淋巴瘤和合并免疫不全的淋巴瘤多由此机制发生但其它类型淋巴瘤中 ,基因异常是多种多样的在中老年患者中 ,多处染色体异常的病例很多 ,多阶段的异常形成集聚产生的后果有待研究,(3)胃癌,1990年Burke首次报道1例与EBV相关的胃癌 1991年Shibata检测出伴有大量淋巴细胞浸润的未分化胃癌中有EBVDNA次年,他检测了没有大量淋巴细胞浸润的胃腺癌 128例,其中22例含EBVDNA同时在淋巴结肺或肝的转移灶中也存在EBVDNA应用ISH法对EBV进行定位,发现阳性检测例的癌细胞核内及核仁中几乎都有EBERs表达1993年