第八章色谱法导论.ppt

1 反 1 2 二氯乙烯2 顺 1 2 二氯乙烯3 溴氯乙烷4 1 2 二氯乙烷5 1 4 二氟苯6 三氯乙烯 一 色谱法概述 色谱法的发展色谱法的分类色谱法的特点 色谱法的发展 1906年 俄植物学家M Tswett分离植物色素 物叶的色素植组成 叶绿素a 蓝绿色 叶绿素b 黄绿色 胡萝卜素 橙色 叶黄素 黄色 植物色素的分离 固定相 CaCO3颗粒流动相 石油醚 植物色素的分离 流动相有液体也有气体 固定相有固体也有液体 色谱带有有颜色的 紫外色带 无色的 色谱法分类 按流动相和固定相所处状态分按固定相的固定形式分按分离过程机制分 按流动相和固定相所处状态分 气相色谱 GC 气液色谱气固色谱液相色谱 LC 液液色谱液固色谱 按固定相的固定方式分 柱色谱纸色谱薄层色谱 按固定相的固定方式分 柱色谱纸色谱薄层色谱 按分离过程机制分 吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱 按分离过程机制分 吸附色谱 利用吸附剂表面对不同组分吸附能力的差异进行分离分配色谱 利用不同组分在两相中分配系数差异进行分离离子交换色谱 利用离子交换原理排阻色谱 利用多孔性物质对不同大小分子排阻的差异 进行分离 色谱法的特点 分离效能高可以分离100多个组分灵敏度高检测10 11 10 13g痕量物质分析速度快几分钟 十几分钟一个周期应用范围广气 液 固体 几乎所有物质缺点 未知物的定性比较困难色谱法的实质是组分的分离 二 色谱法的分离原理 样品在固定相与流动相之间进行分配 很快达到分配平衡 当流动相流过时 样品将在流动相和新的固定相中又达到分配平衡同时原来仍在固定相中的样品与新的流动相之间也会形成新的分配平衡 随着流动相的不断流过 它们携带分配平衡后的样品 沿着柱子向前流动 在流动相中分配多的A组分在前 在固定相中分配多的B组分在后 从而分离 分离的组分在柱中是一个组分段 所以出一个峰 色谱分离原理 分配系数 分配比 容量因子 容量比 cs 组分在固定相中的浓度 cm 组分在流动相中的浓度p 组分在固定相中的质量 q 组分在流动相中的质量Vm 色谱柱固定相体积 Vs 色谱柱流动相体积 三 色谱图及常用术语 色谱图 试样各组分经色谱分离后 从柱后流出进入检测器 检测器将各组分浓度 或质量 的变化转换为电信号 电压或电流 再由记录仪记录下来 所得的电信号强度随时间变化的曲线 即为流出曲线 也称为色谱图 或者叫作色谱峰 色谱图 基线 常用术语 基线 柱中只有流动相流过时 检测器的响应信号记录值峰高h 色谱峰顶点与基线的垂直距离区域宽度峰底宽 Wb半峰宽 1 2h处的峰宽 W1 2标准偏差 0 607h处的峰宽为2 峰面积 对称峰A 1 065hW1 2 常用术语 保留值 表示试样中各组分在色谱柱内停留状况的一个指标 反映了组分分子与固定相分子间作用力的大小 通常用时间或载气体积来表示用时间表示的保留值用体积表示的保留值 用时间表示的保留值 单位 min s等 死时间 tM 不被固定相保留的组分 从进样到出现最大峰所需的时间 也即流动相流经色谱柱所需的时间保留时间 tR 试样从进样到出现最大峰所需的时间调整保留时间 tR tR tR tM L 柱长度 u 流动线速度 用体积表示的保留值 单位 mL 死体积 vM 不被固定相保留的组分 通过色谱柱所消耗的流动相体积 可由死时间确定保留体积 vR 试样从进样到出现最大峰所通过的流动相体积调整保留体积 vR vR vR vM 相对保留值 也称为选择性因子 为两组分的调整保留值之比 一般我们选择tR2 大于tR1 所以 值一般大于1 越大 分离效果越好 与柱温 组分性质 固定相流动性性质有关 与柱长 柱径 填充 流动相流速无关 由色谱图得出的结论 色谱峰的个数 判断组分的个数色谱峰的保留值 定性分析色谱峰的面积或峰高 定量分析相对保留值 固定相与流动相的选择是否合适保留值 区域宽度 评价色谱柱分离效能的好坏 四 色谱法基本理论 a A B组分未分离 b A B组分分离不完全 c A B组分分离完全 两组分的分配系数有差异区域扩散速率小于区域分离速率 受哪些因素影响 塔板理论 速率理论 塔板理论 塔板理论的假设 1 色谱由一系列连续的 相等的水平塔板组成 每一塔板高度为H 理论塔板数n L H2 在柱内一小段H内 组分可在两相间迅速达到平衡3 流动相进入是间歇的 而非连续 每次进入为一个塔板体积4 所有组分纵向扩散不计5 分配系数K恒定不变 塔板理论的结论 理论塔板数n大于50 可得到峰形基本对称的曲线只要被分离组分分配系数K有差异 只要n足够大 均可进行分离n与半峰宽及峰底宽的关系 如果若tR一定 那么n越大 H越小 则色谱峰越窄 柱效能越高 塔板理论的优点及局限性 优点 提出了计算和评价柱效能高低的因素 而且很直观缺点 1 纵向扩散不能忽略2 分配系数与浓度无关只能在有限的浓度范围内成立3 色谱柱中没有真正的平衡体系 塔板理论解决的问题 解释流出曲线的形状 正态分布 浓度极大位置 评价柱效的公式 不能解释 影响塔板高度的因素 不同流速下塔板高度为何不同 影响柱效的本质问题 n越大 H越小 柱效越高 但是n越大只是说明在色谱柱中组分分配次数更多 但是不能确定能否组分是否能分开 决定组分分开的因素是组分的分配系数差别 柱效只是说明柱分离效能发挥的程度 为了弥补以上理论不足 发展了速率理论 速率理论 1956年荷兰范弟姆特速率理论 A 涡流扩散项系数 B 分子扩散项系数 C 传质项系数 平均线速 A B C越小 H越小 n越大 柱效高A B C越大 H越大 n越小 柱效低 A 涡流扩散项 起因由于流动相流经填充物的不规则空隙时 其流动方向改变 形成紊乱的类似 涡流 的流动而引起 涡流扩散过程示意图 填充不规则因子 dp 填充物平均直径 结论dp越小 采用小颗粒填充物 越小 颗粒均匀 A就越小 B 分子扩散项 纵向扩散项 起因 样品在纵向上的浓度梯度而造成的扩散 弯曲因子 与填充物有关 即由于填充物中固定相颗粒的存在 使分子自由扩散受到阻碍 扩散程度降低 Dg 组分分子在其气相中的扩散系数 组分分子量大 Dg小 柱温高 Dg大 柱压大 Dg小 载气分子量大 Dg小 流动相平均线速 结论 采用分子量较大的载气 较高的载气流速 控制较低的温度 可使分子扩散项系数减小 C 传质阻力项 起因 物质系统由于浓度不均匀而发生的物质迁移过程中存在的阻力 Cg 气相传质阻力项系数 Cl 液相传质阻力项系数 Cg 气相传质阻力项系数 即为气相传质过程中 待测试样组分从气相移动到固定相表面的过程中进行分配时 因分配缓慢而引起色谱峰的扩张 k 容量因子 dp 填充物平均直径 Dg 组分在气相中的扩散系数 结论 采用颗粒小的填充物 及分子量小的载气 Cl 液相传质阻力项系数 由组分分子从气液界面扩散至固定液内 达到平衡后再返回气液两相界面的传质过程中存在的阻力 k 容量因子 df 固定液液膜厚度 Dl 组分在液相中的扩散系数 结论 降低液膜厚度 范氏方程 总的影响因素 填充物的均匀程度 填充物粒度的大小 流动相的种类和线速 固定相的液膜厚度 柱效 色谱分离的动力学因素 由理论塔板数来衡量 如果若tR一定 那么n越大 H越小 则色谱峰越窄 柱效能越高 选择性 两峰间的距离衡量色谱的选择性 距离越大选择性越好 一般以 表示 五 分离度 a 两组分没有完全分离 b 两组分完全分离 但柱效不高 c 两组分分离不完全 但柱效较好 d 两组分分离完全 且柱效很好 分离度 分辨率 分辨度 分离度 色谱峰中相邻两峰分离程度的量度 是相邻两峰保留值之差与两峰峰底宽的平均值之比 若峰底宽难测量时 以半峰宽计 并认为半峰宽为峰底宽的一半 Wb W1 2 Rs1 5 两峰完全分离 分离度公式 1 n理论塔板数 n越大 Rs越大 n L H 降低塔板高度H来增加塔板数2 kB 容量因子 kB 增大也可使Rs增大3 相对保留值 1才可进行分离 1不能分离 六 色谱的定性分析和定量分析 定性分析定量分析 定性分析 利用纯物质进行对照相对保留值法已知物的峰高加入法保留指数定性法与其他方法结合 利用纯物质进行对照 相对保留值法 分别测出待测组分物质i与基准物质s的调整保留值 求出相对保留值 is 由求出的 is与文献值比较后进行定性 已知物的峰高加入法 首先作出未知物样品的色谱图然后在未知物样品中加入某已知物 又得一色谱图峰高增加的组分即可能为这种组分 保留指数定性法 柯瓦指数 1 规定正构烷烃的保留指数为其碳原子数乘以100 如正戊烷 正己烷 正庚烷的保留值分别为500 600和7002 z z 1为正构烷烃的碳数 测得碳数为z z 1以及样品i的调整保留时间分别为tR z tR z 1 tR i 且tR z tR i tR z 1 那么Ix 为组分的柯瓦指数3 由求出的Ix 值查阅文献 推测未知物到底为何物 与其它方法结合进行定性a 与质谱 红外 核磁的结合鉴别b 与化学法结合 某些基团发生反应后 峰消失 据此初步判定试样含有那些基团 可用预装柱 c 用不同检测器大致鉴别 氢火焰检测器对有机物灵敏 电子捕获器对卤素 氧氮灵敏 根据信号的灵敏程度可以大致判断化合物类型 定量分析 定量分析基础 待测组分的质量或浓度与色谱峰的峰面积或峰高成正比 响应信号的测量 峰面积峰高乘以半峰宽法 适于对称峰 A 1 065hW1 2峰高乘以平均峰宽法 适于不对称峰 A 1 2h W0 15 W0 85 剪纸称重法自动积分仪法峰高测量法峰高乘以峰底宽法A h W 适于低而宽的峰 校正因子 绝对校正因子相对校正因子 相对校正因子 组分i与标准物质s的绝对校正因子之比 面积校正因子 峰高校正因子 定量方法 归一化法 适于全部组分出峰 内标法 不要求全部组分出峰 内标标准法 不要求校正因子 外标法 标准曲线法 归一化法 优点 简单 准确 受操作条件影响小缺点 样品中组分必须全部都有可测量的色谱峰 测量低含量或微量物质时误差较大 m为待测物质质量 wi为组分i在试样总量中所占的比例 内标法 将一定量的纯物质作为内标物加入到准确称量的试样中 根据试样和内标物的质量以及被测组分和内标物的峰面积或峰高求出组分的含量