第八章消化系统疾病动物模型.ppt

2020 3 31 1 第八章消化系统疾病动物模型 Theanimalmodelsofdigestivessystemdiseases 第一节急性胃炎动物模型 急性胃炎动物模型 2020 3 31 3 Wistar大鼠 雄性 300g 实验动物 一 酸制剂诱发急性胃炎模型 急性胃炎动物模型 大鼠禁食24h 在清醒状态下 用下述试剂或物质灌胃 1 水杨酸制剂 如20mmol L阿司匹林或水杨酸溶液 按100mg kg体重灌胃 2 2ml10mmol L的醋酸或2ml不同浓度的盐酸 1 10 100mmol L 3 2ml同种动物胆汁或2mmol L的牛磺胆酸 4 15 的乙醇 2 4 可单独或几种合用 2ml左右 灌胃 操作方法 急性胃炎动物模型 4h后处死动物 剖检可见胃内发生急性弥漫性炎症改变 胃粘膜表面有浅表糜烂 出血 粘膜层内见中性粒细胞浸润 结果 病变 急性胃炎动物模型 2020 3 31 6 碱性肠液倒流入胃 刺激胃粘膜可引起炎症 即胆汁反流性胃炎 常见于原发性或继发性幽门功能紊乱或胃切除术后 本法取上部小肠的碱性肠液注入已结扎幽门的同种大鼠胃内 使之对胃粘膜产生持续刺激 形成胃炎 造模原理 二 胆汁返流性胃炎模型 急性胃炎动物模型 2020 3 31 7 Wistar大鼠 雄性 180 220g 实验动物 二 胆汁返流性胃炎模型 急性胃炎动物模型 2020 3 31 8 1 制备上部小肠液 2 向胃内注入小肠液 2ml 只 正常对照组注入2ml生理盐水 缝合腹壁 腹腔注射阿托品5mg kg体重 以抑制胃液分泌 利于胃粘膜损伤模型的形成 3 处死大鼠 开腹 结扎贲门 取出胃 沿胃大弯剪开 用滤纸吸干表面水分 立即称量胃重 以胃湿重 体重之比 胃系数 表示胃水肿程度 4 肉眼观察并计数整个胃粘膜出血点数 作为损伤指数 操作方法 急性胃炎动物模型 2020 3 31 9 模型组动物胃系数和损伤指数明显增加 肉眼观察模型组胃粘膜充血 水肿 皱襞减少 颜色暗红 并有大量散在出血点 结果 急性胃炎动物模型 2020 3 31 10 第二节慢性胃炎动物模型 2020 3 31 11 三 大鼠慢性萎缩性胃炎模型 病因 酗酒 用药不当 饮食习惯不良 幽门螺杆菌感染 自身免疫 造模评价 组织病理学是评价造模成功的最主要指标 主要观察和测量胃粘膜厚度 粘膜肌层厚度 腺体数量 壁细胞数量 固有层炎细胞浸润程度和肠化生发生率等 2020 3 31 12 造模方法 综合法一胆汁 去氧胆酸钠 热水 主动免疫综合法二去氧胆酸钠 热糊 主动免疫综合法三去氧胆酸钠 酒精 氨水 吲哚美锌氨水单因素法 2020 3 31 13 综合法复制伴有幽门螺杆菌感染的慢性萎缩性胃炎模型 饮用去氧胆酸钠水 免疫损伤 饮寒凉胆汁 饮食不洁和 或肌饱失常 HP灌胃 2020 3 31 14 第三节急性胃溃疡动物模型 2020 3 31 15 溃疡病的病因 致溃疡因素 胃酸 胃蛋白酶 非甾体抗炎药不合理应用 幽门螺杆菌感染等 防御因素 粘液 碳酸氢盐屏障 粘膜屏障 粘膜血流量 胃上皮细胞的更新 表皮生长因子和内生性前列腺素等 溃疡的形成主要由于防御因素和致溃疡因素的平衡失调所致 2020 3 31 16 应激法 幽门结扎法 药物法 醋酸法 常用的方法 急性胃溃疡动物模型 在抗溃疡药物药效学试验中 水浸应激法 幽门结扎法和醋酸法制备的胃溃疡模型为必做实验 利血平法和乙醇法可任选其一 乙醇组胺促胃液素肾上腺类固醇水杨酸盐血清素利血平保泰松等 一 应激性胃溃疡模型 应激性胃溃疡模型 应激刺激 造模机制 血管收缩 胃运动亢进 副交感神经 垂体 肾上腺系统兴奋性 应激性溃疡 胃酸 胃蛋白酶和胃泌素分泌 胃粘膜缺血 缺氧和抵抗力 交感神经兴奋性 应激性胃溃疡模型 Wistar大鼠 160 180g 雌雄不限 实验动物 器材 大鼠固定钢板或束缚笼 恒温水浴装置 应激性胃溃疡模型 2020 3 31 20 应激束缚笼 应激性胃溃疡模型 2020 3 31 21 禁食 不禁水 24h 将动物固定 笼或固定器 垂直浸于18 20 的恒温水浴槽中 水面浸至剑突水平 水浸泡7h后取出 处死动物 立即开腹检查 胃的固定及处理 操作方法 应激性胃溃疡模型 2020 3 31 22 水浸3h 胃粘膜即发生损伤 7 8h胃粘膜可出现多发性 出血性糜烂小点 20h胃粘膜病变相当严重 但溃疡改变不超过粘膜肌层 且以 腺胃 含胃体和胃窦 为重 应激性溃疡在腺胃部沿血管走行分布 表面覆盖凝血块 去除凝血后可见深褐色条索状溃疡 结果 应激性胃溃疡模型 2020 3 31 23 长度 宽度 点数 溃疡程度的评定 应激性胃溃疡模型 1 溃疡指数 溃疡的长径大于lmm者 直接测量其长度 每lmm为1分 宽度大于lmm 则计分加倍长度和宽度都小于lmm 按溃疡点数计 每点计0 5分 将每只动物的累计总分作为该动物的溃疡指数 在组间进行比较 2020 3 31 24 记分 溃疡程度的评定 应激性胃溃疡模型 1 溃疡指数 点状淤血为1分 线状淤血 长度小于1mm为2分 1 2mm为3分 3 4mm为4分 大于5mm为5分 将全胃分数的总和作为该大鼠的溃疡指数 2020 3 31 25 模型组溃疡指数 给药组溃疡指数溃疡抑制百分率 100 模型组溃疡指数 溃疡程度的评定 应激性胃溃疡模型 根据溃疡指数推算 发生溃疡的动物数溃疡发生百分率 100 实验动物数 2020 3 31 26 胃溃疡发生率高 重复性较好 中枢抑制剂 抗胆碱药 制酸药对其有明显对抗作用 方法简单 结果可靠 迄今仍是研究抗溃疡药物的常用模型 水温应保持恒定 动物禁食期间 如自食粪便会影响实验结果 模型评价与注意事项 应激性胃溃疡模型 2020 3 31 27 应激束缚笼的大小应与动物匹配 松紧度合适 雌性大鼠更易引起应激性溃疡 受试药物一般在应激前30 60min给予 雷尼替丁0 135g kg西咪替丁 甲氰咪胍 1 0g kg体重 模型评价与注意事项 应激性胃溃疡模型 二 幽门结扎法胃溃疡模型 幽门结扎法胃溃疡模型 通过手术结扎幽门 使胃内胃酸 胃蛋白酶潴留 对胃粘膜造成侵蚀而形成溃疡 成年大鼠 雄雌均可 造模机制 实验动物 幽门结扎法胃溃疡模型 2020 3 31 30 1 给药3天 实验前大鼠禁食 24h 不禁水 2 自胸骨剑突下沿腹中线切开腹壁 切口约2 3cm 在左侧肋缘部位用手指轻轻上推暴露胃 3 在胃幽门下穿结扎线 勿伤及血管 将幽门结扎 注意勿将邻近的其他器官 血管结扎 同时经十二指肠给予受试药 缝合腹壁切口 用纱布包扎切口 操作方法 幽门结扎法胃溃疡模型 2020 3 31 31 幽门结扎法胃溃疡模型 2020 3 31 32 4 幽门结扎后 停止供水供食 术后18h处死大鼠 取胃固定 剖检 5 沿胃大弯剪开胃壁 洗净胃内容物 将胃壁展开 胃粘膜面向上用大头钉固定在蜡板上 6 用肉眼或放大镜观察胃粘膜面 记录每只动物产生的溃疡数 溃疡程度 溃疡面积 或溃疡指数 及病变的情况 幽门结扎法胃溃疡模型 2020 3 31 33 幽门结扎法胃溃疡模型 2020 3 31 34 结果 形成的溃疡主要发生在对胃液抵抗力较弱的前胃部 瘤胃 多为圆形或椭圆形 但病变较表浅 属于胃粘膜急性出血性糜烂 与人类胃溃疡的典型病变差距较大 幽门结扎法胃溃疡模型 2020 3 31 35 病变评价 1 溃疡面积通过溃疡中心量取的最大纵径和横径S d1 2 d2 2 式中S为溃疡面积 d1为通过溃疡中心量取的最大纵径 d2为通过溃疡中心量取的最大横径 可计数 前胃部溃疡面积 以其总和作为溃疡指数 幽门结扎法胃溃疡模型 2020 3 31 36 病变评价 2 溃疡程度 Okabe法 在解剖显微镜下测量溃疡面积 将每只鼠溃疡面积的综合分为5个等级作为溃疡指数 溃疡面积总和 mm2 1 1213 2526 3738 50 50mm2或穿孔溃疡指数 1级2级3级4级5级 幽门结扎法胃溃疡模型 2020 3 31 37 病变评价 根据溃疡指数可进一步计算 溃疡抑制百分率 100 溃疡发生百分率 100 对照组溃疡指数 给药组溃疡指数 对照组溃疡指数 形成溃疡动物数 实验动物数 幽门结扎法胃溃疡模型 2020 3 31 38 造模方法简单 溃疡发生快 成功率可达85 100 用于观察药物对溃疡形成的预防作用 本法规定大鼠禁食48 72h 如大鼠体重小于180g 禁食24 48h 这样动物可以耐受手术 若大鼠体重超过180g 禁食48 72h 可提高胃溃疡发生率 在实验过程中 大鼠单笼饲养 笼底网眼应足以使粪便容易漏下 防止动物因自食粪便而影响溃疡形成 评价和注意事项 幽门结扎法胃溃疡模型 2020 3 31 39 在幽门结扎时 勿影响胃壁血管 勿牵扯幽门和用器械钳夹胃壁 干扰实验结果 结扎时间的长短 室温可直接影响溃疡的形成 观察药物对溃疡的影响时 动物应预先给药或同时给药 若粗制剂可采用灌胃给药 应确认胃内药物已排空后方能结扎幽门 粗制剂可在结扎幽门的同时采用十二指肠内注入给药较好 给药方法也可以连续给药5d 每天1次 第3天给药后开始禁食 末次给药后3h手术结扎幽门 评价和注意事项 幽门结扎法胃溃疡模型 三 乙醇诱发胃损伤模型 急性胃溃疡 乙醇法 2020 3 31 41 1 破坏胃粘膜屏障的完整性减少胃粘膜中前列腺素 氨基己糖含量 降低胃粘膜血流量 减小胃粘膜跨膜电位差 破坏主细胞减少粘液分泌 引起胃粘膜微循环障碍等 2 细胞内钙超载和细胞凋亡 急性胃溃疡 乙醇法 造模机制 成年大鼠 性别不拘 大鼠禁食不禁水24h 最后1次给予受试药 给药体积为1 0ml 100g体重 后3h 灌服无水乙醇1ml 只 1h后开腹取胃 以10 甲醛液胃腔内固定后检查胃粘膜损伤程度 评价损伤程度以各组动物的溃疡指数进行组间比较 阳性对照药可选用雷尼替丁 剂量0 135g kg体重 灌胃给予 急性胃溃疡 乙醇法 实验动物 操作步骤 2020 3 31 43 15分钟即可造成明显的胃粘膜损伤 且时间越长损伤越严重 损伤主要发生在 腺胃部表现为粘膜充血 水肿 细胞坏死 伴有糜烂 出血及纵行的条索状出血坏死 急性胃溃疡 乙醇法 结果 2020 3 31 44 乙醇性胃溃疡的程度与乙醇的浓度成正比 一般乙醇浓度40 以上可引起胃黏膜明显损伤 80 以上时出现明显破溃 坏死 因此制备胃溃疡模型时多采用75 以上乙醇或无水乙醇 也可用盐酸 乙醇 50 乙醇 O 15mmol L盐酸 给大鼠灌胃 1ml 100mg 造成溃疡 称为酸乙醇性溃疡 急性胃溃疡 乙醇法 模型评价及注意事项 四 利血平诱发胃溃疡模型 急性胃溃疡 利血平法 2020 3 31 46 利血平是外周交感神经阻滞药 能耗竭肾上腺素能神经末梢内儿茶酚胺类递质 引起胃粘膜损伤 可减弱肾上腺素能神经的功能 使迷走神经兴奋性相对升高 胃酸分泌增加 胃及血管平滑肌收缩加强 可耗竭中枢及外周神经以及其他组织的多巴胺 使多巴胺的细胞保护作用减弱 可减少胃粘膜NO含量 降低胃粘膜的抗损伤能力 从而引起胃溃疡 急性胃溃疡 利血平法 造模机制 成年小鼠 雄雌均可 动物禁食不禁水24h后 灌胃给予受试药后1h 腹腔注射利血平5mg kg体重 18h后处死动物 取胃按上述方法用10 甲醛液固定 沿胃大弯剪开胃 平铺于白纸上 观察溃疡发生情况 急性胃溃疡 利血平法 实验动物 操作步骤 2020 3 31 48 损伤主要发生在腺胃部 可呈现条索状出血点 瘀血斑或糜烂灶 利血平的剂量不宜过大 否则动物容易死亡 给利血平后处死动物的最佳时间 可根据预实验结果确定 该模型的稳定性与动物体质 禁食时间 利血平剂量 室温等因素有关 应尽量控制实验条件一致 阳性药对照可以选用雷尼替丁0 135g kg体重 或西咪替丁 甲氰咪胍 1 0g kg体重 均灌胃给予 急性胃溃疡 利血平法 结果及评价 2020 3 31 49 五 吲哚美辛诱发胃溃疡模型 急性胃溃疡 利血平法 2020 3 31 50 造模原理 环氧合酶是花生四烯酸合成前列腺素的关键限速酶 前列腺素E通过增加粘液和碳酸氢盐分泌 促进粘膜血流增加 细胞保护等机制 在维持胃粘膜防御和修复功能中起重要作用 环氧合酶受抑制 可使胃粘膜生理性前列腺素E合成减少 大剂量吲哚美辛显著抑制环氧合酶活性 致使胃粘膜防御因素减弱而形成溃疡 实验动物 体重160 180g大鼠 雌雄各半 操作方法 大鼠禁食不禁水24h 皮下注射吲哚美辛20 30mg kg体重 7h后处死动物 观察溃疡情况并测量溃疡指数 溃疡主要位于腺胃部 表现为与长轴平行的线状 点状淤血 阳性对照药可选雷尼替丁 灌胃给予 吲哚美辛粉用5 碳酸氢钠溶液配 10mg ml 再用蒸馏水稀释成2mg ml 此溶液为等张 pH 7 5 8 0 2020 3 31 52 模型评价与注意事项 本模型胃溃疡发生率高 重复性好 缺点是溃疡比较表浅 胃损伤程度与动物体质 禁食时间 吲哚美辛剂量 给予后的时间等有关 观察药物的抗溃疡效果一般应预先给药 给药后30 60min再给吲哚美辛 可采用阿司匹林口服或腹腔注射 150mg kg体重 复制类似的胃溃疡模型 2020 3 31 53 第四节慢性胃溃疡动物模型 慢性胃溃疡动物模型 一 醋酸诱发慢性胃溃疡模型 慢性胃溃疡动物模型 在大鼠胃浆膜面浸渍或在浆膜下注射一定量的醋酸 由于醋酸的腐蚀作用使胃粘膜损伤而造成溃疡 溃疡呈圆形或卵圆形 深常可累及胃壁各层 造成穿透性溃疡 溃疡的形状 部位及组织学上胃壁组织的坏死和修复情况均与人类溃疡类似 溃疡愈合过程缓慢 常出现反复 是一种慢性顽固性溃疡 该溃疡模型多用于研究药物对慢性溃疡愈合过程的影响 成年大鼠 性别不限 慢性胃溃疡动物模型 造模机制 实验动物 2020 3 31 56 1 胃粘膜注射法2 胃浆膜浸蚀法 慢性胃溃疡动物模型 操作方法 2020 3 31 57 1 胃粘膜注射法大鼠禁食24h 自由饮水 乙醚麻醉 常规消毒开腹 暴露胃 在腺胃部前壁的窦体交界处 用小号注射针在浆膜下注入30 醋酸0 03ml 然后缓慢出针 勿使醋酸溢出 用生理盐水清洗胃壁创面 将胃送回腹腔 缝合腹壁创口 手术后常规喂养 术后24h按体重随机分组 模型组灌胃给予蒸馏水 给药组给予不同剂量受试药物 每天1次 连续给予10d 术后第11天处死动物 剖腹 结扎幽门及贲门 胃内注入10 甲醛液10ml 将胃放入同一浓度甲醛液中再固定10min 使胃的内外层固定以便测量 慢性胃溃疡动物模型 操作方法 2020 3 31 58 2 胃浆膜浸蚀法用直径5 5m的圆形滤纸片蘸满冰醋酸 贴在腺胃部前壁浆膜面30s 同法重复1次 然后用适量生理盐水清洗掉冰醋酸 将胃送回腹腔 缝合腹壁创口 也可在腺胃部前壁的窦体交界处将内直径5mm 长30mm的玻璃管垂直放置于浆膜面上 向管腔内加入冰醋酸0 2ml 使其接触浆膜面1 5min 然后用生理盐水棉签蘸去冰醋酸 慢性胃溃疡动物模型 操作方法 2020 3 31 59 术后3 5d可形成溃疡 溃疡一般呈圆形 卵圆形或不规则形 中心凹陷 四周微隆起 密布毛细血管 已愈合的溃疡 周围稍有隆起 表面红润 可见愈合的痕迹 一般术后第5日溃疡形成最为严重 以后缓慢愈合 但病变有反复 直径6mm以下的溃疡40天可完全愈合 大的溃疡可残留80 200天 慢性胃溃疡动物模型 病变 大鼠慢性胃溃疡模型 慢性胃溃疡模型 2020 3 31 62 成功率高 重现性好 溃疡深而大 与人类的慢性溃疡极为相似 因而可作为筛选治疗慢性胃溃疡药物的实验模型 一般促进粘膜修复药 抗胃蛋白酶药对醋酸性溃疡有明显的促进愈合作用 制酸药 抗胆碱药也具有促进溃疡愈合效果 慢性胃溃疡动物模型 评价和注意事项 2020 3 31 63 操作过程应严格消毒 笼具也应消毒 以免术后感染影响药物的观察治疗 注射的部位要求一致 必需将醋酸注入到浆膜下 切勿穿透粘膜注入胃腔内 发现有误者应弃去以免影响结果 溃疡灶的大小与注射醋酸的量有关 醋酸的量要准确 否则形成的溃疡差异较大 慢性胃溃疡动物模型 评价和注意事项 2020 3 31 64 二 幽门螺杆菌感染性胃溃疡模型 慢性胃溃疡动物模型 2020 3 31 65 造模原理 Hp含有大量尿素酶 能迅速分解食物中尿素产生氨 氨中和胃酸使局部pH值增高 使细菌不被胃酸杀灭 Hp能分泌产生细胞毒素 引起细胞损伤 使细胞空泡化 导致胃粘膜完整性破坏 从而形成胃炎及胃 十二指肠溃疡 单纯给动物灌服一定量的Hp菌液 只能在感染动物的胃粘膜造成炎症反应 很少引起胃粘膜破损 溃疡 因此 多在动物胃溃疡模型的基础上 使动物感染Hp 常用动物有小鼠 大鼠 沙土鼠等 2020 3 31 66 操作方法 BALB c小鼠 在胃大弯窦部粘膜挂上带有腐蚀性药物的棉线 造成胃溃疡 在此基础上感染幽门螺杆菌 加重病变程度 SD大鼠 先用热烙法复制胃溃疡 在此基础上灌胃给予Hp菌液 沙土鼠 动物禁食禁水1d 第2天灌胃给予50 乙醇0 3ml 之后继续禁食禁水 第2天灌胃给予HP菌液上 下午各1次 隔日上午再灌胃给予菌液1次 2020 3 31 67 第五节急性和慢性肝损伤动物模型 2020 3 31 68 常用的肝损伤物质 四氯化碳D 半乳糖胺硫代乙酰胺刀豆蛋白A 2020 3 31 69 一 四氯化碳急性肝损伤模型 2020 3 31 70 CCl4是无色透明液体 不溶于水 在肝内CCl4经NADPH和肝微粒体细胞色素P450混合功能氧化酶的作用 生成活泼的三氯甲基自由基 CCl3 和氯自由基 这些自由基能与细胞内和细胞膜上大分子发生共价结合 引起富含不饱和脂肪酸的生物膜发生脂质过氧化 导致膜结构和功能完整性的破坏 肝细胞损伤坏死 三氯甲基自由基还能抑制细胞膜和微粒体膜上钙泵的活性 使Ca2 内流增加 从而引起细胞中毒死亡 三氯甲基自由基能与蛋白质形成共价键 损害线粒体使NADH及ATP在肝内生成减少 脂肪酸氧化受抑制 影响肝脏能量生成障碍 并使三酰甘油和脂肪酸在肝细胞内蓄积 造模机制 大鼠用CCl40 2ml 100g体重做皮下注射 用CCl40 5ml kg体重一次性口服 根据所用CCl4剂量和时间的不同 肝脏的损伤程度不同 一般在给予CCl4后16 24h血清丙氨酸氨基转移酶 ALT 和天门冬氨酸氨基转移酶 AST 活性升高 并能反映肝损伤的程度 形态学上表现为肝小叶中央区坏死和脂肪变性 操作步骤 结果 2020 3 31 75 1 CCl4肝损伤模型是最常用的急性肝损伤模型 造模方法简单 成功率高 重复性好 价格低廉 2 CCl4剂量不宜过大 以免造成动物中毒死亡 3 CCl4是无色澄清的有毒液体 难溶于水 一般用花生油 橄榄油 豆油等植物油混合成所需浓度 4 用CCl4复制肝损伤模型的主要缺点是 不同动物个体肝损伤的程度差异较大 小鼠接受CCl4后肝脏病理学改变与血清ALT等生化指标改变的相关性不如大鼠好 5 CCl4可从呼吸道 皮肤吸收 对人体有毒性 注意防护 注意事项与模型评价 2020 3 31 76 二 D 半乳糖胺急性肝损伤模型 D 半乳糖胺本身并无毒性 也不直接损伤肝细胞 D 半乳糖胺是肝细胞磷酸尿嘧啶核苷的干扰剂 进入体内后与磷酸尿苷结合 形成磷酸尿苷 半乳糖胺复合物 致使磷酸尿苷耗竭 从而使依赖其生物合成的核酸 糖蛋白 脂糖等物质的合成受抑制 限制了细胞器及酶的生成和补充 细胞器 生物膜受损 钙离子内流 从而造成肝细胞损伤 D 半乳糖胺引起细胞膜损伤可能与细胞膜中糖成分的改变有关 即已糖代替了中性糖介入细胞膜 导致膜分子结构发生变化 2020 3 31 77 二 D 半乳糖胺急性肝损伤模型 D 半乳糖胺致急性肝损伤的剂量取决于动物状态等因素 剂量一般按500 850mg kg体重 也有用200 400mg kg体重 一次性腹腔注射 2 24h出现不同程度的肝损伤 如剂量超过1000mg kg体重时 常造成广泛性肝坏死或动物中毒死亡 一般于注射D 半乳糖胺后24 36h血清ALT AST活性升高 血清胆红素总量增加 血清总蛋白和清蛋白含量明显降低 镜检可见肝细胞变性 坏死 组织化学显示肝细胞糖原和RNA减少 脂肪堆积 2020 3 31 78 二 D 半乳糖胺急性肝损伤模型 方法简便 成功率高 重复性好 其病变仅限于肝脏 在引起肝坏死的剂量下 不引起其他脏器病变 对实验人员安全 因此 D 半乳糖胺肝损伤模型是目前公认的研究病毒性肝炎发病机制和药物治疗效果的较好模型 D 半乳糖胺与CCl4所致肝损伤的组织学改变明显不同 CCl4损伤主要表现在肝小叶中央静脉周围区大量肝细胞坏死和出血 脂肪变性十分明显 而D 半乳糖胺引起的损伤则呈弥漫性 多发性片状坏死 脂肪变性不如CCl4明显 细胞内有大量PAS染色阳性的毒性颗粒 嗜酸性小体较多见 与人类病毒性肝炎的肝损伤类似 2020 3 31 79 四 刀豆蛋白A急性肝损伤模型 ConA是一种植物蛋白 是可活化T细胞的丝裂原 ConA进入小鼠体内后可引起与人类类自身免疫性肝炎相似的肝损害 ConA诱发肝损害主要与下列因素有关 活化T淋巴细胞 巨噬细胞 促进细胞因子释放 如TNF IL 2 IFN 等与早期肝细胞损害关系密切其他如粘附分子 趋化因子 一氧化氮 肝细胞凋亡等也参与了ConA所致肝损伤的发病过程 2020 3 31 80 四 刀豆蛋白A急性肝损伤模型 小鼠尾静脉注射ConA3h后 即见血浆ALT AST开始升高 8h后升高明显 升高的趋势和速度与ConA剂量呈正相关 当给予ConA剂量为20mg kg体重 2h后肉眼可见肝脏淤血 变暗 并逐渐加重 8h后逐渐减轻 光镜下可见肝内大量T淋巴细胞浸润 在门管区尤为明显 部分门管区淋巴细胞浸润呈 套袖 样改变 肝窦内红细胞淤积 注射后8h可见肝细胞核破裂和凋亡小体等 肝内有点状 片状肝细胞坏死 坏死区内见淋巴细胞浸润 2020 3 31 81 四 刀豆蛋白A急性肝损伤模型 本模型是由淋巴细胞介导的肝损害模型 很好地模拟了人类病毒性肝炎 自身免疫性肝病等疾病 是研究这些肝病发病机制和治疗药物的较理想模型 ConA所致肝损害 无需预先致敏 一次性尾静脉注射后2h即可见肝细胞损害 8h肝损害达高峰 制作快速 简便 ConA致肝损害具有剂量依赖性 选用剂量0 15 30mg kg体重时 肝损害程度随药物剂量加大而加重 当剂量达20mg kg体重以上时 8h内出现小鼠死亡 病变具有肝脏特异性 ConA静脉注射后8h 组织病理学检查未发现肺 肾 脾 心等肝外器官损伤 2020 3 31 82 五 四氯化碳慢性肝损伤模型 造模原理 四氯化碳反复多次给药 易造成慢性肝中毒 致使肝细胞变性 坏死及纤维组织增生 甚至发生肝硬化 由于肝小叶结构紊乱 静脉回流受阻 肝静脉与门静脉高压 促进肝内动静脉吻合支形成 造成肝细胞供血减少 血清清蛋白降低 血清转氨酶活性升高 由于肝内纤维组织增生 血清总羟脯氨酸含量下降 2020 3 31 83 五 四氯化碳慢性肝损伤模型 操作方法 每周皮下注射递增浓度的CCl4 剂量为0 2ml kg 1次 浓度由低向高逐渐增加 依次为5 10 20 和30 每2 3周递增一个浓度 连续3个月 末次注射CCl448h后 测定血清ALT AST活性 血清总蛋白 清蛋白及总羟脯氨酸含量 取出大鼠肝脏 称重 计算肝脏系数 g 100g 并对肝脏进行组织病理学检查 药物作用的观察多采用预防给药 即从注射CCl4之前3 4d开始 每日1次 连续3个月 阳性对照药可用联苯双酯0 15g kg体重 2020 3 31 84 五 四氯化碳慢性肝损伤模型 注意事项 1 所用CCl4浓度开始不宜过高 否则易引起动物死亡 CCl4浓度增加的速度可根据动物状态掌握 当大部分动物状态不佳并出现死亡时 不应增加浓度 2 采用颈背部皮下注射CCl4 个别动物可出现局部炎症和硬结 因此应每日更换注射部位 2020 3 31 85 第六节肝纤维化和肝硬化动物模型 2020 3 31 86 肝纤维化 肝纤维化是指各种致肝脏损伤因素长期反复作用于肝脏 引起肝细胞变性 坏死和炎症 在修复过程中导致ECM异常增多和过度沉积的病理过程 肝纤维化的形成 主要是由于肝星状细胞激活 ECM成分生成过多 降解相对不足 胶原等ECM在肝内大量沉积所致 在我国肝纤维化和肝硬化的主要病因是病毒性肝炎 血吸虫病 酒精中毒 工业毒物 药物 胆汁淤积 循环障碍和代谢紊乱等 2020 3 31 87 肝纤维化与肝硬化的区别 肝细胞弥漫性变性 坏死 肝内纤维组织增生 肝细胞结节状再生 这三种病变反复交错进行 肝内血循环改建 假小叶形成 肝硬化 2020 3 31 88 一 四氯化碳肝纤维化肝硬化模型 如果长期反复多次给予CCL4 可导致肝内纤维增生 逐渐形成肝硬化 该模型较为可靠 复制时间较短 肝纤维化进展稳定 适合于肝纤维化发生 发展过程的动态观察和研究 是目前国内外常采用的动物模型 2020 3 31 89 一 四氯化碳肝纤维化肝硬化模型 操作方法 1 皮下注射40 50 CCl4植物油溶液 首次5ml kg体重 以后2ml kg体重 每周2次 共10周 动物自由饮水进食 2 制备肝脏组织石蜡切片 HE和胶原纤维染色 进行病理学检查 2020 3 31 90 一 四氯化碳肝纤维化肝硬化模型 结果 第2周 肝小叶中央区出现片状肝细胞变性坏死 未见明显纤维组织增生 第4周 除肝细胞变性坏死外 肝内开始形成较薄的纤维间隔 第6周 肝脏纤维间隔进一步增厚 有假小叶形成 第8周 肝组织正常结构破坏 形成厚的纤维间隔 并分割形成假小叶 实验中大鼠成活率在60 左右 2020 3 31 91 二 四氯化碳复合因素模型 造模原理 采用皮下注射CCl4 喂饲玉米面 高脂 高胆固醇食物和饮用酒精等复合因素复制肝纤维化肝硬化模型 玉米面蛋白质含量只能满足大鼠正常蛋白质需要量的一半 且缺乏色氨酸和蛋氨酸 这些氨基酸均属于趋脂物质 它们的缺乏会导致肝脂肪变 以致纤维化 饲料中加入胆固醇又增加机体对胆碱的需要量 酒精也增加对胆碱的需要量 从而加速肝脂肪变的发展 高脂食物有利于形成肝细胞脂肪变性 脂肪变性的肝细胞对CCl4损伤作用敏感 酒精能增强CCl4的毒性作用 可直接引起肝细胞线粒体损伤 复合因素造成大量肝细胞坏死 肝网状支架塌陷 纤维组织增生 最后发展为肝硬化 2020 3 31 92 二 四氯化碳复合因素模型 结果 大鼠体重下降 第2周时肝细胞变性 坏死 表现为小叶中心出现小片状肝细胞气球样变 脂肪变性 坏死和间质轻微炎症反应 镜下未见明显纤维增生 血清ALT AST活性升高 血清清蛋白含量减少 肝脏羟脯氨酸含量增加 第4周为纤维增生改变 除肝细胞变性坏死外 肝内开始有纤维间隔形成 第6周时为假小叶形成改变 肝脏纤维间隔进一步增宽 肝组织正常结构被破坏 有假小叶形成 导致肝硬化 2020 3 31 93 二 四氯化碳复合因素模型 模型评价 1 CCl4加高胆固醇和酒精饮食所致大鼠肝纤维化 是目前国内外常采用的动物模型 该模型可靠 复制时间较短 肝纤维化进展稳定 适合于肝纤维化 肝硬化发生发展过程的动态研究 是值得应用的一种模型 2 如果动物体重较前一次下降30 以上 可停止注射CCl41次 以减少动物死亡率 坏死后性肝硬化 2020 3 31 95 门脉性肝硬化 假小叶 灵长类肝小叶 2020 3 31 96 A 正常肝小叶 Mallory染色 B C 肝硬化 Massontrichrome 2020 3 31 97 第九节胰腺炎模型 2020 3 31 98 胰液内无活性有活性的的胰蛋白酶原胰蛋白酶引起胰腺自身消化其他酶反应引起胰蛋白酶被激活的原因 1 胆汁返流 2 胰液分泌亢进 3 病毒感染 外伤 药物等造成腺泡的损伤 胆汁和肠液中的肠激酶 激活 发病机制 2020 3 31 99 一 急性胰腺炎模型 牛磺胆酸钠胆胰管逆行注射法 2020 3 31 100 正常情况下主胰管的压力高于总胆管 胆汁不会进入胰管 但当胆总管阻塞时 胆道内的胆汁可被压入主胰管 引起急性胰腺炎 早期牛磺胆酸钠可直接导致胰腺腺泡细胞或小导管壁的细胞溶解 进一步的损害可能是胆盐激活胰酶 如胰蛋白酶 磷脂酶等 产生腺泡自身消化 采用胰管逆行注射法诱发动物急性胰腺炎 是根据胰管 胆管共同通路和胆汁反流理论 模拟人类胆源性胰腺炎的发病机制大鼠的胆管和胰管为共同开口的管道 解剖上称为胆胰管 从胆胰管上分出6 8支胰管的分支进入胰腺实质 造模机制 2020 3 31 101 操作方法 大鼠实验前禁食不禁水12h 3 戊巴比妥钠 40mg kg 腹腔注射麻醉 上腹正中切口进入腹腔 提起胃和十二指肠 显露出胰腺 辨认胆胰管走向 于肝门处用微型无损伤动脉夹夹闭胆总管 以防药液逆流进入肝脏 用4号钝针头朝胰腺方向穿刺十二指肠前壁 在其浆膜下潜行通过十二指肠乳头穿入胆胰管 用手指固定针头 缓慢 约2min 注入3 5 或5 牛磺胆酸钠溶液1ml kg体重 2020 3 31 102 操作方法 另一种穿刺方法是 用4号针头紧贴胆胰管汇入十二指肠处 自肠外穿刺胆胰管 注射完毕拔除针头后继续按住穿刺处约1min 检查无漏胆 逐层关腹 假手术组仅翻动胰腺和十二指肠后关腹 术后15处死动物 解剖时肉眼观察胰腺大体变化 取胰腺等组织 10 中性缓冲甲醛液固定 常规制备石蜡切片 在光镜下观察胰腺等脏器的改变 取血测定血清淀粉酶水平 2020 3 31 103 结果 术后15h血清淀粉酶水平明显升高 肉眼观察 胰腺充血肿胀 包膜紧张 出现不同程度出血坏死 腹腔内可见血性腹水 胰腺周围大网膜和肠系膜出现淡黄色的皂化斑 胃肠道明显水肿 肾脏明显增大 颜色晦暗 光镜检查 于术后15h可见胰腺组织大片出血 凝固性坏死及脂肪坏死 坏死区之间有大量中性粒细胞和单核细胞浸润 表现为急性出血坏死性胰腺炎 2020 3 31 104 模型评价 本模型在病因 发病机制及胰腺病变等方面与人类急性胰腺炎相似 是目前被公认的 比较常用的复制急性胰腺炎的方法 通过改变注射速度 注射持续时间 所用牛磺胆酸钠的浓度或剂量可控制胰腺病