第四讲活血化瘀类方药的研究思路与方法

第四讲第四讲 活血化瘀类方药的研究思路与方法活血化瘀类方药的研究思路与方法 传统中医理论传统中医理论 血瘀证 是指体内血液停滞或血运不畅 阻滞于经脉及脏腑内瘀血 导致疼痛 肿块 出血 皮肤及舌质青紫或瘀斑等一系列病理改变的概括 是中风 痹证 肿瘤等多种疾病的病理基础 血瘀证的病理生理学变化 血瘀证的病理生理学变化 1 血液流变学异常 血液有浓 粘 凝 聚倾向 2 微循环障碍 微动脉与静脉间的微血管血循环障碍 包括 微血流缓慢和淤滞 微血管内凝血 微血管变形 微血管缩窄和闭塞 微血管周围 水肿 瘀血和出血 3 血小板功能亢进 4 血流动力学异常 器官或组织的血流 血管阻力 血流循环障碍 5 生化代谢异常 免疫功能异常 一 活血化瘀方药的研究思路一 活血化瘀方药的研究思路 1 改善高黏滞血症改善高黏滞血症 高黏滞血症 血液流变学异常 微循环障碍 表现 血沉 红细胞压积 红细胞变形能力 纤维蛋白原含量 血小板特性 血栓等 高黏滞血症 是机体血瘀的的病理表现 与高黏滞血症相关的疾病 冠心病 缺血性脑血管病 糖尿病 肾病综合征 慢性肺源性心 脏病等 2 改善组织器官缺血 改善组织器官缺血 途径 扩张动脉 改善血液流变性 改善微循环 改善血管内皮细胞功能 清除氧自由基 减轻组织过氧化损伤等 最常见的组织器官缺血是 心肌缺血 缺血性脑卒中 3 对慢性器官功能减退性疾病的影响 对慢性器官功能减退性疾病的影响 血液循环不良 组织功能障碍 活血化瘀药 改善血液循环 例如 慢性肾衰患者 常伴有血浆黏度及纤维蛋白原浓度升高 血浆黏度的提高导致血流缓慢 肾脏血流减少 慢性肾衰由于尿毒症对红细胞膜的损害 使红细胞的变形能力降低 聚集性增强 难以通过 微血管造成微循环障碍 慢性肝炎 肝纤维化 肝循环障碍 肝脾淤血 中医认为 老年多瘀 老年往往存在动脉粥样硬化等退行性病变 老年糖尿病患者 胰腺功能减退 动脉粥样硬化 降血糖 活血化瘀药 4 对血管痉挛性疾病的影响 对血管痉挛性疾病的影响 偏头痛 与脑血管痉挛有关 发现偏头痛发作期患者血液粘度和血小板聚集率均增加 活血 化瘀中药如川芎 治疗偏头痛常用药物之一 雷诺氏病 表现为肢端微循环障碍 活血化瘀治法 症状可缓解 5 对慢性炎症的影响 对慢性炎症的影响 上呼吸道慢性炎症 慢性胃炎 慢性阑尾炎 盆腔炎等 始发因素虽不一定是血液循环障碍 因病程长 机体正气衰减 经脉气血瘀阻 以活血化瘀为主 有利于促进炎症感染过程的终止 6 对组织纤维化的影响 对组织纤维化的影响 组织纤维化往往是慢性炎症反应的结果 血管内皮细胞和炎症细胞的激活可分泌大量的氧自由基以及炎症因子 并引起病灶内结缔组 织细胞增殖 胶原大量产生 活血化瘀药可以对抗以上异常 二 研究药物活血化瘀的常用方法二 研究药物活血化瘀的常用方法 一 实验动物的选择 一 实验动物的选择 以大鼠和家兔较为常用 其他如猫 犬也可 二 动物模型的制备 二 动物模型的制备 一 现代医学病理模型模拟血瘀证病变较常用 二 根据中医病因建立血瘀证动物模型 常见的病因有外伤血瘀 寒凝血瘀 离经之血血瘀 肝郁血瘀 污秽之血血瘀 老年血瘀 如 血液流变学改变和微循环障碍的血瘀证模型 1 高分子右旋糖酐静脉注射造模法 高分子右旋糖酐静脉注射造模法 原理 静脉注射后被红细胞吸附 在红细胞间起桥梁作用 致红细胞聚集 血流阻力增加 循环不畅 造成微循环障碍 造模材料 高分子右旋糖酐 平均分子量 20 40 万 家兔或大鼠 操作举例 高分子右旋糖酐 经加热 使完全溶解于生理盐水中成 10 溶液 家兔耳缘静 脉注射 15ml kg 应在 3min 内推注完毕 症状 模型出现口唇紫绀 舌质暗红 微血管血流缓慢 红细胞聚集 血管周围有渗出和出 血 血粘度升高 红细胞电泳时间延长 持续 12 24 小时 李仪奎主编 中药药理实验方法 学 第二版 138 2 凝血酶 凝血酶 氨基己酸造模法氨基己酸造模法 原理 凝血酶 6 氨基己酸 引起全身弥散性血管内凝血 特别是肾小球内出现大量微血栓 操作举例 大鼠 颈外静脉插管 滴注 10 u ml 凝血酶生理盐水溶液 每小时 10u 左右 共 输 4 小时 同时皮下注射 6 氨基己酸 100mg kg 4 小时后采血测量各项指标 3 放射损伤型血瘀造模法 放射损伤型血瘀造模法 原理 动物经 射线照射后 可出现符合血瘀证的血液流变学和微循环障碍 操作举例 以家兔为实验对象 用 60Co 射线照射 照射率 69 9 78 8 R min 总量 400 rad 于照射前及照射后固定时间进行微循环指标检查 局部血流动力学障碍的血瘀模型 1 实验性心肌缺血造模法 实验性心肌缺血造模法 冠脉结扎法 气囊压迫冠状动脉法 异丙肾上腺素或垂体后叶素注射 2 肾上腺素 去甲肾上腺素 肾上腺素 去甲肾上腺素局部滴注造模法 3 血栓性造模法 血栓性造模法 动脉血栓形成造型法 静脉血栓形成造型法 静脉血栓形成造模法举例 静脉血栓形成造模法举例 p247 原理原理 静脉结扎引起血流淤滞 局部血管内皮损伤 暴露内皮下的胶原纤维 从而激活 凝血因子 XII 启动内源性凝血系统 凝聚的血小板与局部形成的凝血因子致使局部血栓形成 活血化瘀药物对此有抑制作用 方法方法 大鼠麻醉后 仰位固定 沿腹正中线切开皮肤 3cm 左右 打开腹腔 找到下腔静 脉 于左肾静脉下方用丝线结扎静脉后 缝合腹壁 观察内容观察内容 2h 后 打开腹腔 在结扎下方 2cm 处用止血夹夹住血管 取注射器将该段血 管内血液吸尽 然后纵向剪开管腔 观察有无血栓形成 如有 取出血栓在滤纸上吸干表面血 液 称取湿重 干燥后称血栓干重 根据中医的病因病机理论建立动物模型根据中医的病因病机理论建立动物模型 1 肝郁血瘀模型 肝郁血瘀模型 原理 肝气郁结 疏泄不利 血的运行可因之阻塞 在暴怒时机体分泌大量的肾上腺素 使 红细胞聚集指数增加 故给予大量肾上腺素模拟暴怒肝郁时血瘀 方法举例 大鼠 皮下注射肾上腺素 每周一次 造模时间 30d 血管收缩 血液停滞等改 变 适用于抗血管痉挛性药物研究 2 寒凝血瘀 阳虚 动物模型 寒凝血瘀 阳虚 动物模型 原理 中医认为气血寒凝 使血流受阻 造成血行不畅 形成血瘀之证 故用寒冷的方法模 拟病因 可造 阳虚 寒凝血瘀证模型 方法举例 成年大鼠 15 C 持续冷冻 4 小时左右 直至动物出现寒战停止 兴奋减弱期 阴盛阳衰 寒凝血瘀 机体失代偿能力 3 肝气郁结和寒凝型血瘀证模型 肝气郁结和寒凝型血瘀证模型 原理 寒入经脉造成经脉挛缩拘急 血液凝涩不能通畅而瘀滞 情绪暴怒时 机体分泌大量 肾上腺素 使红细胞聚集指数增加 方法举例 大鼠 0 1 肾上腺素皮下注射 0 2ml 每日 2 次 每日 1 次冰水浸泡 5min 1 2 日后及形成血瘀模型 4 气虚型血瘀证模型 气虚型血瘀证模型 原理 气为血帅 气行血行 气虚则不能推动血的运行而造成血液流变性的改变 方法举例 大鼠 脾气虚模型 以 200 大黄灌服 2ml 100g 肾虚模型 用泼尼松水溶液灌胃给予 4 mg 100g 游泳劳损气虚模型 大鼠 水温 43 0 5 水槽中游泳 以出现自然沉降的时间为大鼠游泳耐 疲劳时间 全组 50 大鼠出现自然沉降时 全组动物停止游泳 连续 14 日 5 气虚 气虚 血瘀模型血瘀模型 原理 中焦为气血生化之源 饥则气损 心功能不全患者最初表现为气虚或停饮 气虚不能 推动血行 故可选择饥饿加普萘洛尔共同造成气虚 血瘀则选用静注高分子右旋糖酐法 方法举例 家兔 每日每只兔投食量 40g 正常为 70g 不加青菜 每日灌服普萘洛尔 10mg kg 3 日之后动物出现少动蜷卧 心尖搏动减弱 心率减慢 第 4 日起 静脉注射 10 高分子右旋糖酐 5ml kg 每日 2 次 连续 2 日 6 离经之血离经之血 型血瘀证模型型血瘀证模型 原理 中医理论 血行应随 经脉流行不止 环周不休 如果血不循经 溢于脉外 则 为瘀血 故人工将血凝块或鲜血置于动物体内 作为瘀血模型 方法举例 家兔腹腔自身血凝块造模法 家兔取血 凝固后置于腹部结肠下 8 12 日后处死 动物 取腹腔内残存血块量度 小鼠腹腔血液造模法 抽取抗凝羊血 制成羊红细胞悬液 注入小鼠腹腔内 药物干预后 抽取腹腔内液观察残留红细胞数量 判断吸收情况 7 热毒血瘀证模型 热毒血瘀证模型 原理 热毒血瘀是温热性疾病的病理变化 注射内毒素 动物高热及弥漫性血管内凝血 反 复的皮质激素注射造成动物高凝状态 制备方法 家兔 肌内注射氢化可的松 10 15 mg kg 每天 1 次 连续 7d 第 8d 耳缘静脉注 射细菌内毒素 2h 后 动物出现发热 持续 4h 以上 同时血液凝固度 粘度 血小板聚集率 等异常 有微血栓形成和毛细血管内有血小板淤积 8 高脂血瘀造模法 高脂血瘀造模法 污秽之血血瘀模型 原理 证治准绳 曰 污秽之血为瘀血 高脂血症患者的血有 污血 特点 高脂血症动物 可作为血瘀证动物模型 方法举例 以高胆固醇和脂类喂养动物 家兔常用 经数周喂养就可以产生明显高脂血症 经数月能形成早期的动脉粥样硬化病变 9 老年多瘀动物模型 老年多瘀动物模型 衰老血瘀造模法 原理 老年病 如冠心病 脑血栓 糖尿病 肿瘤等多属血瘀证范畴 老年大鼠具有老年病血瘀相似之处 制备方法 常选择大鼠 雌雄不限 但雄性大鼠血瘀病理发展较早 且明显 故雄性多用 选择鼠龄两年以上 观察指标常选血液流变学及微循环有关的指标 三 主要观察指标 三 主要观察指标 1 血液流变性测定 血液流变性测定 血液流变学 Hemorheology 是一门研究血液和其组成成分流动变形规律的科学 包括全血比粘度 全血还原粘度 血浆粘度 红细胞电泳时间 血小板电泳时间 纤维蛋白 原测定 红细胞沉降率 血沉 及红细胞变形能力 红细胞压积 等 10 多项指标 1 红细胞压积测定 红细胞压积测定 一定量的抗凝全血 离心沉淀 沉下的红细胞体积与全血体积之比 即为红细胞压积 红 细胞压积增高 表示血液浓度增高 主要测定方法 红细胞压积管法 温氏法 静脉血 1 2ml 双草酸盐或 EDTA K2 抗凝 自动血细胞分析仪 静脉血 1 2ml EDTA K2 抗凝 2 血液黏度测定 血液黏度测定 黏度是液体黏性的量度 黏度越高 流动性越小 反之 越大 血液黏度随切变速率变化而变化 切变率低时 血液黏度提高 切变率高时 黏度下降 一般规定 观察药物对血液黏度的影响 至少要测定由高到低 2 个以上不同切变速率下的黏 度值 血浆 血清黏度取决于构成血浆 血清的各种成分 主要影响因素依次为 胆固醇 纤维蛋白原 甘油三脂 脂蛋白 IgG IgA 白蛋白 测定血浆 血清的黏度 可分析 判断患者血黏度异常的原因和药物影响的环节 常用血黏度测定方法 毛细管测定法和旋转测定法两种 目前采用后种方法较多 有专门的仪器 3 血浆纤维蛋白原含量测定血浆纤维蛋白原含量测定 用不同稀释度血浆测定其凝血酶时间 可反映纤维蛋白原含量 纤维蛋白原增加 血液粘度提高 血液凝固性增加 凝血加快 4 红细胞电泳时间红细胞电泳时间 红细胞的聚集和分散同其表面所带的负电荷有关 提高红细胞表面的负电荷密度 红细胞之 间的同种负电荷静电排斥力增大 红细胞处于分散状态 并导致血液粘度下降 用细胞电泳仪 测定红细胞电泳速度 可反映血细胞的聚集性 电泳速度减慢 表明细胞膜上负电荷密度降低 细胞排斥力减弱 而易于聚集 5 红细胞变形能力测定红细胞变形能力测定 红细胞的变形能力反应红细胞的柔顺性和硬度 在一定压力推动下 红细胞变形能力越强 通过口径细小的毛细血管速度越快 反之 则不易通过 从而影响微循环 红细胞变形能力愈 强 全血粘度愈低 6 血小板聚集功测定 比浊法 血小板聚集功测定 比浊法 血小板悬浮在血浆中时 具有一定的不透明度 即浊度 浊度与血小板数成正比 当一束光线投射到富血小板血浆时 透过光的减弱程度与血浆中的血小板数成比例 加入可 以引起血小板聚集的物质如 ADP 胶原 花生四烯酸等时 血小板发生聚集 分散的血小板 数减少 透光率增加 从而定量地和动态地显示血小板的聚集程度和速度变化 7 血栓形成测定血栓形成测定 有体外血栓和体内血栓形成测定法 以血栓形成时间 血栓长度 血栓重量为指标 反映血凝状态 观察药物抗血栓形成作用 2 微循环功能测定 微循环功能测定 大多采用活体观察法 如人体手指甲襞 眼球结膜 舌尖微循环观察 家兔眼球结膜微循环 大鼠或家兔肠系膜 肝脏 肾脏 肺 软脑膜等脏器微循环 小鼠耳 廓微循环观察等 1 微血管形态 微血管形态 包括外形 管径 毛细血管网交点数 病理情况下 微血管会出现痉挛 淤张 膨大和扭曲 等畸形表现 同时管径缩小 单位面积毛细血管网交点数减少 2 微血流状态 微血流状态 包括微血管中的血色 流态 流速 在微循环中 血色反映含氧程度 红细胞流态最易观察 并将它简称为流态 如应用先进的微循环观察仪器或荧光微血管造影技术 则在微动脉和微静 脉中能看清血细胞轴流和血浆边流的变化 红细胞的流态分为四级 在正常情况下 呈 0 级或 0 I 级 在微循环障碍时 流态出现 I III 级 并可见白细胞贴壁翻滚 白色微小血栓 流速 主要测定的是红细胞流速 3 微血管周围变化 微血管周围变化 包括有无渗出 有无出血 微血管通透性正常时 周围无明显渗出现象 在病理情况下 微 血管壁通透性可升高 导致血管内液体渗漏到组织间隙 从而使微血管轮廓变得模糊 如果微 血管壁完整性受到破坏 损伤较严重可引起出血 在微血管周围可直接见到红细胞 荧光微血管造影技术 不仅能观察到普通显微术能看到的微循环表现 如微血管的形态 口径和长度 血细胞的流 态和流速等 而且能观察到普通显微术不易或不能看到的现象 如血浆流态 微血管通透性 组织液流动和淋巴循环等 此外 荧光微血管造影还可间接判断局部组织或器官的血液灌流量 3 器官的血流量测定 器官的血流量测定 电磁流量计测定法 目前最常用的方法 通常 先分离向器官供血的动脉 如向心肌供血的 冠状动脉 向脑组织供血的颈总动脉 颈内动脉 或椎动脉等 选择大小匹配的电磁流量计探 头 将其安在血管上 经动脉流入器官的血液流量即会被记录下来 3 激光多普勒血流量 有些脏器的血流量包括微循环血流量可采用激光多普勒血流量仪测定 从不动组织和活动的 红细胞反射回来形成的参考光束和多普勒转换光束 通过将两者频率的改变对比转换 可测出 微循环血流量 4 抗动脉粥样硬化作用观察 抗动脉粥样硬化作用观察 动脉粥样硬化 AS 模型的制备 1 高脂膳食喂养法 高脂膳食喂养法 以高脂膳食喂养家兔 大鼠 鹌鹑 鸡等形成 主动脉与冠状动脉的病变一般与血浆胆固醇 Ch 浓度呈正相关 采用高脂膳食喂养动物或 同时加入胆酸盐 丙基硫氧嘧啶 甲亢平 烟碱等以促进外源性脂质吸收 使其超过机体需要 和清除能力 造成动物脂质代谢紊乱 2 动脉内皮损伤法 动脉内皮损伤法 化学性