第四章-酶学分析技术.ppt

第四章酶学分析技术 酶是生物体内活细胞合成的具有高效 特异催化作功能的蛋白质 什么是酶enzyme 目前将生物催化剂分为两类 蛋白质酶 核酶 脱氧核酶 底物 substrate S 被催化的物质 产物 product P 反应生成的物质 酶促反应 酶催化的反应 酶活力 酶所具有的催化能力 几个有关名词 丙氨酸 谷氨酸 常见酶类 丙氨酸氨基转移酶ALT或GPT乳酸脱氢酶 LDH 天冬氨酸氨基转移酶 AST或GOT 肌酸激酶 CK 5 核苷酸酶 5 NT 羟丁酸脱氢酶 HBD 一 酶活性 定义 酶活性 enzymeactivity 也称为酶活力 指酶促反应速率 即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量 表示方法 或 式中v 反应速率 P 产物浓度 t 时间 S 底物浓度 注 在实际测定酶促反应速度时 以测定单位时间内产物的生成量为好 二 酶活性单位 一 酶活性单位 定义 表示酶的相对含量 指在一定条件下 单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量 表示方法 惯用单位 一定的反应量 一定的反应时间 国际单位IU mol min Katal单位 mol s 1 惯用单位 20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位 ALP的金氏单位 King 氨基移转酶的卡门氏单位 Karmen 特点 各单位对温度 时间 物质量的定义不同 导致各测定值 参考范围相差很大 彼此间无法比较 现在临床应用较少 卡门氏单位 1 0ml血清在25 340nm 反应体积3 0ml 光径1 0cm时每分钟测定吸光度下降0 001 即消耗4 82 10 4 molNADH为一个卡门氏单位 举例 金氏单位 100ml血清ALP在37 与底物作用15min 产生1mg酚 2 国际单位IU mol min 定义 在规定条件下 25 及其他最适条件 每min催化1 mol底物转变为产物的酶量 为1U 1U 1 mol min IFCC 2001年37 3 Katal单位 定义 1Katal是在规定条件下 每秒钟催化1mol底物转变为产物的酶量 1Katal 1mol s IU与Katal单位的关系 1katal 60 106U 1U 16 67nkatal 三 酶促反应动力学 以产物生成量 或反应物减少量 为纵坐标 反应时间为横坐标作图所得到的一条曲线 称为反应进程曲线 或反应时间曲线 速率曲线 时间曲线 一 延滞期 lagphase 延迟期 特点 为反应的初始阶段 反应速率一开始时较慢 通常为几秒到几分钟 t1t2时间t图5 1酶促反应进程曲线 吸光度A 线性期 非线性期 R1 R2 延滞期 孵育期 延滞期 二 线性期 此阶段酶促反应速率基本保持恒定 对底物而言 为反应速率与底物浓度 S 的零次方成正比的零级反应 即不受底物浓度的影响 而只与酶活性浓度成正比 此时底物的消耗量小于5 反应速率为反应初速率 酶活性浓度越高 线性期就越短 线性度 判断线性期的一个指标 指吸光度 A 相对于时间 min 变化的可以接受的程度 线性度 前半段 A min 后半段 A min 前半段 A min 后半段 A min 2 100 线性度值越小则线性越好 一般判断标准 不大于15 否则判为非线性 特点 可代表酶促反应速度 三 非线性期 偏离线性期 平坦期 进入非线性期的原因 反应的不断进行 底物消耗越来越多 酶变性失活增加 可逆反应增强 产物抑制增加等使得反应速率明显下降 特点 若为单底物的反应 则此时反应速率与单底物浓度 S 的一次方成正比 为一级反应 偶联 工具酶与待测酶 工具酶与工具酶之间的联合 工具酶 将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶 工具酶有氧化还原酶类 转移酶类和水解酶类 分类 第二节酶学分析的类型 表7 2常用工具酶的名称及其缩写符号 名称缩写符号名称缩写符号 乳酸脱氢酶LDH苹果酸脱氢酶MDH6 磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD谷氨酸脱氢酶GLDH葡萄糖氧化酶GOD胆固醇氧化酶COD磷酸甘油氧化酶GPO过氧化物酶POD 己糖激酶HK肌酸激酶CK丙酮酸激酶PK甘油激酶GK脂蛋白脂肪酶LPL胆固醇酯酶CE脲酶肌酐酶 常用品工具酶主要是氧化还原酶类 部分转移酶类和水解酶类 工具酶的质量要求工具酶的用量一般较多 故要求工具酶来源广泛 价廉易得 纯度要求不太高 可降低制备成本 但对工具酶中的杂质也要有一定的限制 以保证工具酶有一定的比活性 减少或避免一些能干扰测定的副反应 NAD P 或NAD P H偶联的脱氢酶及指示反应 NADH和NADPH在340nm有光吸收特性 可用紫外分光光度计直接测定 另外 NAD P H还有强烈荧光 其激发光波长为365nm 荧光波长为460nm 荧光法的灵敏度比分光光度法高 如ALT测定工具酶是LDH 二 酶活性的测定方法 测定方法分类 按照仪器检测方法分类 分光光度法 浊度法 荧光法 放射性核素法 电位滴定法 电极法 量气法 按照反应时间分类 分为定时法 连续监测法和平衡法 按照检测对象分类 分为直接法和间接法 1 定时法 原理 定时法是固定时间法的简称 是指测定反应开始后一段时间 t1 t2 产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法 该方法一般需要在反应进行到一定时间后用强酸 强碱 蛋白沉淀剂等终止反应 特点 优点 简单 因为最后测定时酶促反应已被终止 故比色时不需要保温设备 显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响 缺点 如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程 t1 t2 是否为零级反应 故难以确保测定结果的准确性 定时法与两点法 终点法的区别 2 连续监测法 continuouemonitosing 每隔一定时间 10 60s 连续测定酶反应中产物或底物的变化量称为连续监测法 又称动力法或速率法 终点法的测定两个时间点 该法进行多点连续测定 优点 多点测定结果 连接成线 很容易找到成直线的区段 因而可选择线性反应期来计算酶活性 不需终止反应 测定结果较准确 省时 省试剂 缺点 分光光度计必须有保温装置 而且P或S应是可直接测定的化合物 如需加入其他试剂则必须考虑它们对待测酶活性是否有影响 3 平衡法 end paintamalyin 测定酶反应开始后某一段时间内 从t1 t2 产物或底物的总变化量称为终点法 而t1和t2是反应历程中的两个点 故又称两点法 优点 简便 测定产物时 酶反应被终止 显色剂的选择只考虑对酶活性的影响 分光光度计不需保温装置 缺点 无法了解这段时间的反应是否都是零级反应 故难以保证结果的真实性 计算公式 产物的增加量每单位规定的保温时间1000 ml 酶单位 升 每单位规定的产物增加量实际保温时间实际标本用量 ml 分光光度法测定的公式 A测定 A对照 V总 106每单位规定的保温时间酶单位 升 L V标实际保温时间 第三节影响酶活性测定的因素一 标本1 溶血RBC中某些酶活性比血高 如LDH高150倍 AST高15倍 ALT高7 5倍 2 抗凝剂某些酶可被抗凝剂抑制 如EDTA 草酸盐 可抑制需Ca2 的AMS和需Mg2 的CK 5NT ALP等 酸酶活性测定都用血清 3 样品存放时间 各种血清酶稳定性不同 如ACP CK在室温下迅速失活 AMS GGT则很稳定 二 测定条件的影响1 温度温度对酶活性的影响包括两个方面 一方面是温度升高 反应速度加快 另外一方面温度升高 会发生热变性 使酶活性降低 1 温度的选择37 反应速度快 单位时间反应物质变化量大 测定灵敏度增加 保温时间短 25 30 可使单位时间的散热较少 温度便于恒定 很多实验数据的物理化学较难定在30 进行 IFCC建议30 作为参考方法的标准温度 2 温度系数将温度每升高10 后反应速度相当于原来的倍数 称为温度系数 Q10 Q10表示温度对反应速度影响的大小 2 pH 1 改变底物的解离状态 影响酶与底物结合 2 改变酶活性中心必需基因的解离状态 影响酶活性 3 改变酶的三维空间构象 使酶变性 4 使亚基解聚 3 缓冲液性质酶活性不仅受缓冲液pH影响 也受缓冲液性质的影响 选择缓冲液应考虑的因素 1 缓冲液中弱酸的解离数pka必须接近酶测定时的Ph 如ALT测定pH7 4 磷酸pka6 7 LDH测定pH8 8 二乙醇胺pka8 8 ALP测定pH10 碳酸pka10 32 2 缓