安医大生殖医学课件04胚胎的培养

胚胎的培养第一附属医院生殖医学中心经典图片

---配子/合子精子图片人未成熟卵母细胞（GV/MI)两性配子的比较精子卵子形成时间8-10周12-50年大小(微米)5*25140贡献仅提供子代细胞核DNA遗传信息卵子同时提供细胞核和线粒体DNA遗传信息受影响环节干细胞损伤环节-环境影响纺锤丝存在老化-年龄因素精子、卵子的遗传差异精子的形成过程精子与卵的形成过程受精过程视fertilization.flv频精子(sperm)与卵子(ovum)结合形成受精卵(zygote)的过程，称为受精(fertilization)。受精定义正常受精时间：排卵后24小时内。正常受精部位：输卵管壶腹部。正常受精的前提：卵巢正常排卵输卵管伞拾卵必须有精子参与精子获能及发生顶体反应卵子发生皮层反应精、卵﹙两性﹚原核形成及融合受精卵子受精的过程受精精子获能spermcapacitation精子顶体表面糖蛋白被女性生殖道分泌物中的α、β淀粉酶降解;顶体膜结构中胆固醇和磷脂比率与膜电位发生改变;共同作用下使顶体膜稳定性降低，具有受精潜能；主要部位是子宫和输卵管。受精顶体反应acrosomereaction获能的精子与次级卵母细胞放射冠接触，精子头部外膜和顶体前膜融合、破裂，释放顶体酶，溶解放射冠和透明带，称为顶体反应；精子穿越放射冠和透明带受精卵子的皮层反应一旦精子穿过透明带与次级卵母细胞质膜融合→次级卵母细胞放出第Ⅱ极体完成减数分裂(Ⅱ)→卵原核;次级卵母细胞膜内侧的皮质颗粒释放→溶酶体酶→水解透明带的ZP3﹙zoneprotein3:透明带上存在的种族特异性精子受体﹚→透明带反应(变性)→屏蔽其它精子;皮质颗粒的膜与卵细胞膜融合→次级卵母细胞及其外侧糖蛋白层结构改变→细胞表面负电↑→制止精子质膜与卵膜的融合。皮层反应模式图透明带精子已获能并发生顶体反应次级卵母细胞及其皮质颗粒精子已穿透透明带进入卵周间隙精子质膜与卵膜融合、皮质颗粒释放第二极体释出精子头部进入精子尾部断裂在卵膜外两性原核形成透明带反应屏蔽其他精子进入合子形成及个体形成过程精子与卵子结合过程受精卵受精卵（1天）2-细胞期胚胎4-细胞期胚胎早期胚胎培养技术胚胎体外培养

是胚胎操作的一项基础技术，在体外受精、胚胎分割、细胞核移植、胚胎运输、胚胎发育研究和胚胎转基因操作等一切与胚胎生物技术有关的研究或操作中被广泛应用。早期胚胎的代谢特点

不同物种代谢具有差异性，是不同物种胚胎培养基不同的根本大原因。早期胚胎所利用的物质随胚龄增长而改变，胚胎代谢在晚桑葚胚到早囊胚时期发生改变，从利用丙酮酸到主要利用葡萄糖。发育阻断

体外培养条件下，每种动物都有特殊的阻断时期，即发育阶段特异性阻断：小鼠，2-细胞；大鼠，2和8细胞；兔，桑葚胚；人，4和8细胞阶段等。影响胚胎体外发育的因素营养因素：葡萄糖、乳酸盐和丙酮酸盐、蛋白质、氨基酸、肌醇和磷脂酰肌醇环境条件：培养液体积、渗透压和离子浓度变化、氧气含量变化、含氧基对胚胎发育的影响、维生素、肌醇和磷脂酰肌醇体系、胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠体系及二巯基乙醇胚胎体外培养系统

胚胎培养系统包括培养液、温度、气相等。不同动物的培养液不同。培养液分为简单培养液与复合培养液，复合培养液中除含简单培养液的成分外，还含有氨基酸、维生素及微量元素。另处，有些动物的胚胎培养还需要与体细胞如膜细胞、滋养层细胞以及胎儿成纤维细胞等进行共培养（co-culture).胚胎体外培养系统培养液：简单化学特定培养液／复合培养液温度：不同物种温度不同(37～38.5℃)气相氧气：高氧或低氧CO2：5%或6%简单化学特定培液

简单化学特定培液是指无机物与有机物，按一定要求配制而成的培养液：TCM199,Earle’sMedium等。复合培养液（含肽类生长因子培养系统）

在化学特定培养液中添加外源生长因子：胰岛素样生长因子（IGFS）表皮生长因子（EGF）集落刺激因子-1（CSF-1）白血病抑制因子（LIF）转化生长因子-a（TGF-a）

课件:2008/1/30共同培养系统

是将胚胎与其它组织细胞一起培养，组织细胞产生的物质供胚胎发育所需要，克服发育阻断：输卵管上皮细胞培养系统子宫粘膜上皮细胞培养系统卵泡颗粒细胞培养系统卵丘细胞培养系统水牛大鼠肝细胞培养系统

课件:2008/1/30共同培养系统的建立免输卵管上皮细胞培养系统卵泡颗粒细胞培养系统

课件:2008/1/30免输卵管上皮细胞培养系统上皮细胞获取：取兔输卵管，除去输卵管表面脂肪，用PBS+10%FBS冲洗2-4遍，剪开输管并剪成小段。在4℃条件下，用2ml0.02%胶原酶-II消化45min，用TCM199+10%FBS收集输卵管上皮细胞，离心洗涤三次，获取上皮细胞。细胞培养：TCM199+10%FBS为培养液，细胞接种到24孔培养板，密度5×105/ml,在37℃,5%CO2条件下培养，24h后细胞开始贴壁增殖，每48h换液一次，培养60h后（贴壁率达80%以上），即可共培养。

课件:2008/1/30卵泡颗粒细胞培养系统卵泡颗粒细胞获取：用针头从兔卵巢中分离卵泡，再从卵胞腔周围得到颗粒细胞，然后放入PBS+10%FBS，用离心机离心两次，每次10min，最后收集颗粒细胞；细胞培养：将沉淀物用TCM199+10%FBS悬浮，用24孔培养皿培养，细胞密度4×105/ml，培养60h后，开始贴壁，72h达到80%，用于胚胎共培养。

课件:2008/1/30体内培养系统兔输卵管培养系统羊输卵管培养系统离体小鼠输卵管培养系统（IMOS）鸡胚培养系统

课件:2008/1/30胚胎培养案单胚胎培养每个液滴仅放1枚胚胎进行培养优点：便于观察记录不足：背离了细胞特性（细胞社会性），操作繁琐，费力，费财。

课件:2008/1/30胚胎集合培养多个胚胎放入同1个液滴行共同培养优点：迎合了细胞自身特性（社会性），促进优质胚胎的获取不足：不便于观察记录

课件:2008/1