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protein 2 氨基酸与蛋白质的一级结构 四 毛细管电泳毛细管电泳技术是将养品点在装有凝胶的 直径为20 75 m内经的毛细管里 进行电泳 优点是分辨率高 样品需要量小 电泳速度快 上样和分离物的检测都能够进行自动化操作 因为毛细管散热性能好 允许使用很高的电压进行电泳 除分离检测蛋白质外 在核酸的序列分析中使用较为普遍 五 电泳后的蛋白质检测 考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法 是根据考马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的 对于一个混合蛋白质的电泳分离来说 它只能检测样品的分离情况 如果被检蛋白质的位置可以确定 可以将该蛋白质的色带切下之后进行脱色 测定脱色液光吸收值 能对该蛋白质进行定量分析 活性染色 根据有活性的目标蛋白质特有的生物化学反应产生的有色物质或另外加入某种能与产物生成颜色的物质来进行检测的 活性染色可以从一个复杂的蛋白质样品中检测到目标蛋白出现的位置 活性染色法在同工酶 例如酯酶同工酶 谷氨酸脱氢酶同工酶 谷氨酰胺合成酶同工酶等 的检测中非常有用 免疫印迹 Immunoblotting 或蛋白质印迹 Westernblotting 是检测目标蛋白质的一项十分有效的方法 一种蛋白质 抗原 能与它产生的抗体专一地反应 在电泳之后 欲检测目标蛋白的存在 可以先将凝胶中的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上 然后用目标蛋白产生的抗体与之产生抗原 抗体反应 最后可用连接有碱性磷酸酯酶或辣根过氧化酶的第二抗体 通用抗体 与第一抗体反应 加入能与抗体共接的酶反应生成有色物质的生色液 即可十分可靠地检到的目标蛋白 七蛋白质的沉降作用及超离心分离沉降速度 dx dt 与蛋白质分子的大小和密度有关 沉降速度法 适用于分离沉降系数不同但密度相近的蛋白质 沉降平衡法 适用于沉降系数相近 但密度不同的蛋白质 沉降系数 当沉降界面以恒定的速度移动时 单位离心场里的沉降速度 用离心法分离细胞亚微结构 差异 速 离心 用不同的离心速度 依据被分离物的大小而将细胞亚结构彼此分离的效果 速度区带离心 将样品铺在稀的蔗糖溶液的顶层 溶液不用于分离而用以抗对流作用 离心完成后 细胞各成分以其大小不同而在离心管中呈区带分布 若离心时间太长 或离心力过大 细胞各成分都会沉降至管底 而达不到分离效果 600g 3min 上清 6000g 8min 上清 40000g 30min 上清 100000g 90min 上清 沉淀 细胞核 沉淀 线粒体 叶绿体 溶酶体 过氧化酶体 沉淀 细胞质膜 高尔基体和内质网膜的碎片 沉淀 核糖体亚基 细胞液 差异 速 离心法 平衡密度梯度离心 用不同的离心速度 依据被分离物的密度而进行分离的效果 通常是将没有纯化的物质铺在密度溶液 如蔗糖溶液 氯化铯溶液为介质 离心管内的溶液密度从底部到顶部是浓至稀的梯度 的顶层 通过离心 160000g 3h 细胞内各成分不停地下沉分别达到与溶液的密度相等时的位置 其介质的密度范围宽于被分离组分的密度 差异 速 离心与平衡密度梯度离心法 第五节蛋白质的一级结构和测定 一 蛋白质一级结构概述蛋白质的结构层次 一级结构 primarystructure 多肽链内氨基酸残基从N端到C端的排列顺序 或称氨基酸序列 二级结构 secondarystructure 多肽链主链不同肽段沿主轴盘旋折叠而形成的空间结构 二级结构是蛋白质结构的构象单元 主要有 螺旋 折叠 转角 无规卷曲 三级结构 tertiarystructure 多肽链在二级结构基础上进一步卷曲折叠 即整个肽链 亚基 的空间形状 三级结构指的是处于充分折叠 具有生物学活性的一个完整的球蛋白的三维结构 四级结构 quaternarystructure 寡聚蛋白质分子亚基之间的相互关系和空间位置 蛋白质测序的一般步骤 首先目标蛋白质分离纯化得到高度纯净的蛋白质样品 1 测定蛋白质分子中多肽链的数目 末端分析 分析多肽链的N末端和C末端 2 拆分蛋白质分子中的多肽链 断裂链内二硫键 3 测定多肽链的氨基酸组成 酸水解或碱水解 4 多肽链部分裂解成肽段 专一性酶解 5 测定各个肽段的氨基酸顺序 6 确定肽段在多肽链中的顺序 7 确定多肽链中二硫键的位置 二蛋白质一级结构测定 目标蛋白质的分离纯化程序主要包括 1材料的选择 2组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液 3蛋白质初步提纯 4选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白 直至完全纯化 5目标蛋白的鉴定 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性 因此 在目标蛋白质的整个分离纯化过程中要在较低温度下 0 4 操作 注意使用蛋白酶 使蛋白质降解的酶 的抑制剂 避免使用剧烈条件 以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏 一 氨基酸的组成分析蛋白质在标准条件下经酸水解后 进行氨基酸的组成分析 通过组成分析基本上可推测出部分水解所产生的肽碎片的数目 二 末端分析 确定蛋白质的肽链组成 通常测定肽链的N 末端 二硝基氟苯 DNFB 法或丹磺酰氯 DNS Cl 法是常用的方法 丹磺酰氯为一种更有效的试剂 灵敏度比DNFB法高100倍 丹磺酰氯分析多肽链的N 末端 水解多肽确定氨基酸组成 确定N末端的氨基酸残基 苯异硫氰酸酯 PITC Edman试剂 确定N末端的氨基酸残基剩下的多肽可以再利用 三 拆开链间或链内的二硫键 1 还原法 用巯基乙醇 HSCH2CH2OH 或二硫苏糖醇等还原性试剂使二硫键打开 还原生成 SH 2 氧化法 常用过甲酸 CHOOOH 作为氧化剂 使二硫键氧生成半胱氨磺酸 磺基丙氨酸残基 四 肽链的部分水解常用胰蛋白酶法 胰凝乳蛋白酶法和溴化氰法等方法 下面是一个典型的多肽 用胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 糜蛋白酶 和溴化氰分别处理所得到的结果 Ala Arg Arg Met Phe Ala Lys Asp Phe Leu Lys胰酶处理 凝乳蛋白酶处理 溴化氰处理 Ala ArgAla Arg Arg Met PheAla Arg Arg MetArgAla Lys Asp PhePhe Ala Lys Asp Phe Leu LysAsp Phe Leu LysLeu LysMet Phe Ala Lys 过甲酸 巯基乙醇 碘乙酸 酶法裂解 胰蛋白酶R1 Lys或Arg 高度专一 水解速度快 R2 Pro不能水解胰凝乳蛋白酶R1 Tyr Trp Phe 水解速度快 Leu Met或His 水解速度缓慢 R2 Pro不能水解胃蛋白酶R1和R2 Phe Trp Try Leu和其它疏水性氨基酸 嗜热菌蛋白酶R2 LeuIlePhe Trp TryVal或MetR2 Pro或Gly不能水解Pro蛋白酶Pro X溴化氰 R1 Met 高度专一 水解速度快 五 肽碎片的氨基酸顺序分析 Edman降解法 专用试剂是苯异硫氰酸 羧肽酶法 羧肽酶A 从C 末端依次降解末端残基 含芳香环的或脂肪烃基较大的残基易被水解 但该酶不能水解C 末端的Arg Lys和Pro 羧肽酶B能专门水解C 末端的Arg和Lys 对其它残基不起作用 如果C 末端第二个残基是Pro 则酶A和酶B都不起作用 羧肽酶C能水解C 末端的Pro 六 片断重叠确定整个肽链的氨基酸顺序 胰酶 Ala ArgArgMet Phe Ala LysAsp Phe Leu Lys糜酶 Ala Arg Arg Met PheAla Lys Asp PheLeu Lys全顺序Ala Arg Arg Met Phe Ala Lys Asp Phe Leu Lys 例 用胰蛋白酶处理某多肽后获得一个七肽 非羧基端肽 这个七肽经盐酸完全水解后获得Met Glu Phe Ala Pro Lys 各1mol 该肽与二硝基氟苯反应后用盐酸水解不能得到任何 DNP 氨基酸 该肽用羧肽酸B处理不能得到任何更小的肽 该肽用CNBr处理得到一个四肽和一个三肽 四肽经酸水解后得到Met Phe和Glu 这个七肽经糜蛋白酶处理也得到一个三肽和一个四肽 四肽的氨基酸组成是Ala Met Pro和Lys 根据上述信息确定这个七肽的氨基酸顺序 1胰蛋白酶作用某肽得到非羧基端肽 说明这个肽段的羧基端残基是赖氨酸 七肽经酸水解得到Met Glu Phe Ala Pro Lys 各1mol 说明Trp被破坏 2该肽与DNFB反应后 酸水解得不到任何DNP aa 说明该肽的N端为Trp 3羧肽酶B作用 不能得到更小的肽说明 C端倒数第二个为Pro Trp Pro Lys4溴化氰作用得到四肽 Met Phe和Glu 说明四肽为Trp Glu Phe Met三肽为Ala Pro Lys5胰凝乳蛋白酶处理得到三肽和四肽 四肽为Ala Met Pro Lys 显然三肽的顺序为Trp Glu Phe 四肽的顺序为Met Ala Pro Lys七肽的顺序为 Trp Glu Phe Met Ala Pro Lys 七 间接方法测定蛋白质的一级结构 测定蛋白质基因的顺序可推测蛋白质一级结构 由于近年来DNA的序列测定相对比较容易 采用测定编码该蛋白质的基因序列来推断蛋白质一级结构 这种方法适用于组织中含量低纯化比较困难的蛋白质 其前提条件就是要能够得到编码该蛋白质的基因 八 数据库提供不同蛋白质顺序的信息在测定一种蛋白质的氨基酸顺序后 按照惯例该蛋白质的顺序信息就进入到数据库中这些数据以及其它更专门化的内容可经WorldWideWeb访问 从而了解到你所需要的有关数据 三蛋白质与生物进化 一 蛋白质一级结构与生物进化以胰岛素和细胞色素c为例说明 示出了细胞色素c种系发生树 1序列比较提供蛋白质结构与功能的信息同源蛋白质 homologousproteins 进化上相关的蛋白质 换句话说 来源不同的同一种蛋白质 例如细胞色素C 胰岛素 在不同生物体内存在的的同一种蛋白质 2序列比较揭示进化上的关系细胞色素c存在所有需氧生物种类的细胞中 该蛋白质在分子水平上提供了从进化上比较生物的一个非常好的范例 种属越近氨基酸残基序列的相似性就越大 二 基因复制和蛋白质家族相似功能的蛋白质具有相似的氨基酸序列 基因复制是进化的一种特别有效的方法 因为一个基因拷贝通过自然选择进化出新的功能 四完全不同的蛋白质可能来自同一个祖先母鸡卵清蛋白和人乳 乳清蛋白之间的序列同源性比较 表明这两种生物活性和起源完全不同的蛋白质 两者之间有48个位置的氨基酸残基相同 三级结构非常相似 来自不同生物体内结构功能相似的蛋白质 可能就是同源蛋白 因为它们来自同一个祖先基因 五蛋白质一级结构的个体差异血红蛋白 hemoglobin Hb 分子病分子病