王亮,2010级,绿色荧光蛋白的应用

绿色荧光蛋白的应用绿色荧光蛋白的应用 王亮王亮 学号 学号 12434100031243410003 来源于水母 Aequorea victoria 的绿色荧光蛋白 green fluorescent protein GFP 现已成为在生物化学和细胞生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之 一 其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时 max 395 nm 小峰在 479 nm 可高效发射清晰可见的绿光 GFP 的高分辨率晶体结构为了解和研究蛋白质 结构和光谱学功能关系提供了一个极好的机会 GFP 已成为一个监测在完整细 胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记 通过突变和蛋白质工程构建的 GFP 嵌合蛋白在生理指示剂 生物传感器 光化学领域以及生产发光纤维等方 面展示了广阔前景 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 GFPGFP 的理论应用的理论应用 1 1 分子标记 分子标记 利用绿色荧光蛋白独特的发光机制 可将 GFP 作为蛋白质标签 protein taggin g 即利用 DNA 重组技术 将目的基因与 GFP 基因构成融合基因 转染合适的 细胞进行表达 然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察 由于 GFP 相对较小 只有238个氨基酸 将其与其他蛋白融合后不影响自身的 发光功能 利用 GFP 的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解 如 细胞分裂 染色体复制和分裂 发育和信号转导等 利用 GFP 来检测目标蛋白 的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的 新方法 除用于特定蛋白的标记定位外 GFP 亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架 质膜 细胞核等等 Shi 等人曾报道将 GFP 融合到大肠杆菌细胞膜表面用作 标记蛋白 这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率 疫苗的研制 构建细胞 生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等 这些都为传统生物学研 究提供了新思路和新方法 成为交叉学科研究的热点 2 2 药物筛选 药物筛选 许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选 这一技术 能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物 荧光探针分布是利 用信号传导中信号分子的迁移功能 将一荧光蛋白与信号分子相偶联 根据荧 光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况 并推断该分子在迁移中的功 能 由于 GFP 分子量小 在活细胞内可溶且对细胞毒性较小 因而常用作荧光 探针 在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂 其中很多涉及到信号分子在细胞器 之间的迁移 利用 GFP 荧光探针 将很容易从数量众多的化合物中判断出那些 化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的 功能 且这一筛选过程简单方便 所需成本也很低 利用 GFP 来进行药物筛选 由于受其必须与迁移的信号分子相偶联 其筛选容量相对较低 但是由于 GFP 在细胞内的穿透性强及独特的发光机制 因而在药物筛选中具有相当大的应用 潜力 3 3 融合抗体 融合抗体 单链抗体 Single chain variable fragment ScFv 是研究得较多的一种小分 子抗体 其优越陛在于可在宿主细胞内大量表达 易于基因工程操作 尤其易 于构建抗体融合蛋白 近年来 关于绿色荧光蛋白融合单链抗体的报道很多 国内也有相关报道 如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合 GFP 真核表达 载体并导人小鼠成纤维细胞 NIH3T3表达并获得成功 因融合抗体具有与抗原结 合及发射荧光两种特性 故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂 直接应 用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等 但近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体 若能成功解决融合抗体的表达问题 则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合 抗体将扮演极为重要的角色 4 4 生物传感器 生物传感器 蛋白质工程技术已经开始采用将一具有信号传导功能分子识别位点的分子结合 到另一分子上来设计生物感受器 绿色荧光蛋白由于其独特的光信号传导机制 以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性 因而 极适于用做活细胞体内的光学感受器 将受体蛋白插入到 GFP 表面的技术已经 成为构建分子感受器的有力工具 这种 GFP 感受器能被用来检测多种分子 如 蛋白质 核酸 激素 药物 金属及其他的一些小分子化合物等 其潜在应用 前景极为广阔 5 Protein5 Protein taggingtagging GFP 蛋白首先被应用在观察活体细胞中蛋白的位置及动态的变化 使用 GFP 进行 此类研究的好处是细胞在实验之前不需要进行固定或破坏 如此便能在几乎不影 响细胞的正常生理作用下进行即时的观察及分析 主要可以应用在 Biological screen 及 Drug screen 上 GFP 蛋白除了能在细胞中标定特定 fusion protein 的位置及存在 另外也能利 用生物分子之间的特殊作用力标定特定 DNA 序列的位置 例如有研究就利用 bac terial lac repressor protein lac I 跟其 DNA 目标之间的特殊强结合力来标 定 lacI 的目标基因 GFP 的 barrel like structure 能确保 GFP 在 fusion protein 中的结构及其发 光的性质 使其适宜接在不同 fusion protein 中表现 但利用 GFP 有期限制性 因为要将 GFP 折叠成具有活性 会发光 的形状可能会花较长的时间 这使得应用 GFP 在短生命周期的蛋白研究中相形困难 6 MonitoringMonitoring ofof genegene expressionexpression 将 GFP 当作报告子基因在生医研究上有很多的应用 主要分成下列两种 1 测知 transcriptase 或 reverse transcriptase 的存在 2 Promoter 强度之研究 7 7 信号转导信号转导 新近研究发现 某些突变的 GFP 能够发生荧光共振能量转移 fluorescence resonance energy transfer FRET FRET 是一种从荧光分子的激发状态 到临近基态接受分子之间量子力学能量转移的现象 FRET 发生的前提条件是 荧光接受分子必须在荧光提供分子释放态所具有的波长范围内接受能量 如果 供应分子和接受分子相互定位在几个纳米之内 则非常利于 FRET 的产生 因 为 FRET 对于两个荧光分子相互间的定位和距离高度敏感 在纳米范围内 两个分子间微小的线性或空间定位关系的破坏可以强烈地改变能量转移的效 率 我们可以通过偶联 GFP 到适当的转录因子 跨膜受体 细胞间信号转导指示分 子 来动态观测活细胞的生理功能 8 8 改进改进 GFPGFP 的应用前景的应用前景 野生型 GFP 合成后需经一定的折叠过程形成正确构象后才有功能 而且在 47 0 nm 处的荧光强度相对较低 为了改善 GFP 荧光特性 如摩尔吸收值及释放 波谱 对 GFP 进行了突变和重组实验 研究人员合成了高 GC 含量的特殊 GFP 并且发现这种 GFP 有更强的荧光强度 此外 用人蛋白质中偏爱的密 码子替代相应的野生型 GFP 中密码子可提高 GFP 在哺乳动物中的表达效率 许多 GFP 突变蛋白 不仅改变了激发和释放波谱 而且提高生色团形成的效 率 溶解度 蛋白质表达等 检测特定类型的细胞 细胞器或特定的细胞内区域中的 pH 值 这样开创了检 测以前所不能到达部位 pH 值的可能性 到目前为止 荧光蛋白已有非常广泛的应用 GFP 可应用于转染细胞的确定 体内基因表达的测定 蛋白质分子的定位和细胞间分子交流的动态监测 免 疫分析 核酸碱基探针分析 以及分子间第二信使钙离子和 cAMP 水平的指示 细胞间隙 pH 变化的检测 另外 GFP 也可以和其他蛋白质形成融合蛋白 作为基因治疗检测指标 但是 GFP 在应用中还发现有许多问题亟待解决 1 荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难 2 多数生物具有微弱的 自发荧光现象 并有着类似的激发和发射波长 这个荧光背景会影响某些 GF P 的检测 3 实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株 可能与 GFP 参与细 胞凋亡过程有关 9 9 光伏发电光伏发电 瑞典研究人员不再盯着植物作为样板 转而将目光投向拥有高超光伏转化能力 的水母 开发出提升收获太阳能的技术 利用水母身上提取的绿色荧光蛋白 G FP 该小组制作的装置可用这些 黏黏绿 将紫外光转化为自由电子 该小组 制造的电池由在二氧化硅基底上被一个小缝隔开的两个简单的铝电极组成 GFP 置于两电极中间并起连接作用 当把紫外光放进来的时候 GFP 不断将光子抓 走 并产生电子进入电路产生电流 同时 GFP 非常廉价 不需要昂贵的添加 剂或昂贵的加工 此外 它还能被封装成独立的不需要外光源的燃料电池 科 学家相信 此能源装置缩小后可用来驱动微小的纳米设备 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 GFPGFP 的实际应用的实际应用 1 1 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 来源于水母 Aequorea victoria 的绿色荧光蛋白 green fluorescent protein GFP 现已成为在生物化学和细胞生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之 一 其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时 max 395 nm 小峰在 479 nm 可高效发射清晰可见的绿光 GFP 的高分辨率晶体结构为了解和研究蛋白质 结构和光谱学功能关系提供了一个极好的机会 GFP 已成为一个监测在完整细 胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记 通过突变和蛋白质工程构建的 GFP 嵌合蛋白在生理指示剂 生物传感器 光化学领域以及生产发光纤维等方 面展示了广阔前景 2 2 应用应用 GFPGFP 基因转染技术示踪组织工程技术构建角膜基质基因转染技术示踪组织工程技术构建角膜基质 目的应用基因转染技术将绿色荧光蛋白 GFP 标记角膜基质细胞 以此为种子细 胞构建角膜基质并对构建过程进行示踪 方法构建携带 EGFP 基因的重组逆转录 病毒载体 PLNCX2 EGFP 转染兔角膜基质细胞 然后将该细胞接种于 PGA 形成细 胞 生物材料复合物 移植于母兔角膜基质板层内 术后8周 组织学切片 HE 染色 荧 光显微镜下对绿色荧光蛋白 GFP 进行示踪观察 结果8周后 组织工程化角膜组 织形成 组织学切片显示 PGA 完全降解 新生组织形成 组织排列规整 荧光显微 镜下见新生组织呈绿色 提示 EGFP 表达 结论组织工程角膜基质的组织学结构与 角膜基质相类似 新生组织表达 GFP 证实组织工程角膜基质组织的构成源于供 体细胞 3 3 绿色荧光蛋白标记检测枯草芽孢杆菌在水体中的存活动态绿色荧光蛋白标记检测枯草芽孢杆菌在水体中的存活动态 基于生物 化学协同控制植物病害的原理 构建了一种由枯草芽孢杆菌和烯酰吗 啉组成的对辣椒等作物疫病具有较好的防治效果的菌药合剂 DMBS 按照农药降 解研究基本规则 采用绿色荧光蛋白 green fluorescent protein GFP 标记技 术和细菌学研究方法研究了 DMBS 在去离子水 地下水 自来水 河水和雨水中 的降解动态 结果表明 GFP 标记可以用于枯草芽孢杆菌在5种水环境中的存活检 测 在 25 1 条件下 枯草芽孢杆菌菌剂和 DMBS 中的枯草芽孢杆菌数量主要 表现为前12 d 迅速下降 此后则随时间的延长在一定的范围内呈变动的上升或 下降趋势 在 50 1 灭菌和不灭菌的条件下 均表现为前12 d 迅速下降 12 d 后趋于稳定或缓慢下降 枯草芽孢杆菌在5种水中的降解速度较慢 在 25 1 和 50 1 条件下存放86 d 后 其含量均在104 cfu mL 以上 培养温度和灭菌 条件对枯草芽孢杆菌在不同水体中存活动态有一定的影响 菌药合剂中的烯酰吗 啉对该菌的存活则没有显著影响 4 一种基于绿色荧光蛋白的蛋白酶体抑制剂细胞筛选模型一种基于绿色荧光蛋白的蛋白酶体抑制剂细胞筛选模型 为建立基于绿色荧光蛋白 GFP 的药物筛选模型 并用此模型从包括中药提取物 在内的化合物中筛选新型蛋白酶体抑制剂 本研究构建了 pGC E1 ZU1 GFP 融合 蛋白慢病毒表达载体并感染 A549 细胞 筛选稳定表达细胞株 用已知蛋白酶体抑 制剂 PS 341 处理细胞 荧光显微镜检测处理前后细胞 GFP 水平变化 结果获得了 稳定表达 pGC E1 ZU1 GFP 的 A549 细胞 这些细胞用 PS 341 处理 24 h 后用荧光 显微镜检测 发现细胞绿色荧光强度相对于对照组明显增强 利用这一模型对一 些化合物进行筛查 发现了一些新的蛋白酶体抑制剂 5 5 绿色荧光蛋白标记的绿色荧光蛋白标记的 D D 氨基酸氧化酶基因在人宫颈癌细胞中的表达研究氨基酸氧化酶基因在人宫颈癌细胞中的表达研究 为了探讨绿色荧光蛋白标记的红色酵母 D 氨基酸氧化酶 DAAO 基因在人宫颈癌 细胞 HeLa 细胞 中的表达及其功能 采用基因重组技术构建了含有 CMV 启动子 和 EGFP DAAO 基因开放阅读框 ORF 的真核表达载体 pIRES DAAO 脂质体法转 染 HeLa 细胞 荧光显微镜下观察转染细胞中绿色荧光蛋白的表达 流式细胞术分 析转染效率并筛选荧光阳性细胞 命名为 HeLa D 以不同浓度的前药 D Ala 处理 HeLa D 细胞 MTT 法检测细胞存活率 结果显示 荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白 在 HeLa D 细胞中表达 流式细胞术成功筛选出 HeLa D 细胞 前药 D Ala 能明显 杀伤 HeLa D 细胞 结果表明 EGFP 可作为报告基因快速筛选 DAAO 表达载体转染 的细胞 DAAO D Ala 自杀基因系统可进一步用于肿瘤的基因治疗研究 6 6 利用绿色荧光蛋白进行利用绿色荧光蛋白进行 microRNAsmicroRNAs 靶点分析的研究靶点分析的研究 目的 利用绿色荧光蛋白作为报告基因 研究微 RNAs microRNAs 与靶点相互作 用 方法 在 pEGFP C1 下游非编码区插入含 miR 122a 作用靶序列 HCV 5 UTR 构建 pEGFP UTR 载体 将 miR 122a 与 pEGFP UTR 共转染 HEK293 细胞 观察增强 绿色荧光蛋白 EGFP 表达强度变化 并与双荧光素酶报告系统比对 结果 miR 122a 能明显抑制含 UTR 靶序列的 EGFP 蛋白表达 与双荧光素酶报告系统相比 绿色荧光蛋白在检测灵敏度上与双荧光素酶相接近 结论 利用绿色荧光蛋白作 为报告基因 能够清楚直观反映 miRNAs 与靶点作用情况 7 7 绿色荧光蛋白标记成人骨髓间充质干细胞的超微结构特征绿色荧光蛋白标记成人骨髓间充质干细胞的超微结构特征 背景 研究表明 绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞免疫学表型 细胞周期 分化潜能等均未发生明显改变 目的 进一步观察绿色荧光蛋白标记对骨髓间充 质干细胞超微结构的影响 方法 分离培养成人骨髓间充质干细胞 抗 CD34 抗 CD105 免疫细胞化学染色鉴定 选第 3 代细胞进行绿色荧光蛋白标记 超薄切片 后用透射电镜观察细胞超微结构 以未经绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞为 对照 结果与结论 骨髓间充质干细胞表达 CD105 不表达 CD34 绿色荧光蛋白标 记后 骨髓间充质干细胞细胞质发出绿色荧光 绿色荧光主要集中于细胞核周围 的胞浆内 远离细胞核的胞浆内荧光强度逐渐减弱 相对于未标记的骨髓间充质 细胞 经绿色荧光蛋白标记后细胞粗面内质网 高尔基体等细胞器较多 而线粒 体相对较少 另外 脂滴和 空泡 样结构也多一些 结果证实绿色荧光蛋白对骨髓 间充质干细胞性状的影响较为局限 是一种较为理想的细胞标记示踪剂 8 8 慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究 目的 观察慢病毒载体转染豚鼠巩膜成纤维细胞的有效性及对细胞活性的影响 方法 转染组用慢病毒携带绿色荧光蛋白 lentiviral mediated green fluorescent protein Lenti GFP 转染豚鼠巩膜成纤维细胞 对照组加入空白培 养液 转染组按最佳感染复数 multiplicity of infection MOI 为 50 100 200 400 加入 Lenti GFP 转染 2d 3d 4d 5d 6d 和 7d 后 在倒置 显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况 流式细胞仪检测转染效率 MTT 法检测病 毒对细胞增殖的影响 结果 Lenti GFP 转染细胞后 48 h 可以看见绿色荧光 在 同一 MOI 值下 随时间延长转染效率增高 第 5 天达到高峰 在 MOI 为 400 转染 5d 时转染效率达 82 86 转染 5d 行 MTT 检测显示 MOI 为 50 400 时 同一 转染时间各组 IOD 值与对照组比较 差异均无统计学意义 均为 P 0 05 结论 慢病毒载体可以在体外稳定而有效地转染豚鼠巩膜成纤维细胞 且不影响细胞活 性 是巩膜成纤维细胞理想的基因转染载体 9 39 3个不同品系小鼠个不同品系小鼠 ESES 细胞的绿色荧光蛋白标记细胞的绿色荧光蛋白标记 用电穿孔法将线性化的质粒 pEGFP N3 分别导入来自 129 ter C57BL 6J 和 BALB c 3 个品系的小鼠胚胎干细胞 MESPU 13 MESPU 35 和 MESPU 62 中 经 G418 筛选 荧光显微镜镜检 阳性克隆扩增 流式细胞仪分选 再扩增以及核 型分析等过程 分别得到核型大于 85 的被 EGFP 稳定标记的细胞株 5 个 129 ter 2 个 C57BL 6J 1 个 BALB c 2 个 分别命名为 MESPU 13 G1 和 MESPU 13 G2 MESPU 35 G1 MESPU 62 G1 和 MESPU 62 G2 从不同品系中各选 一个增殖生长快 形态典型的标记细胞株 进行碱性磷酸酶染色 oct4 基因产 物的表达检测 类胚形成和体内分化鉴定 结果表明所得到的核型正常的 稳定 标记的 ES 细胞系具有原 ES 细胞的典型特征 10 10 共表达共表达 O O 型型 FMDVFMDV 衣壳蛋白和绿色荧光蛋白重组腺病毒的构建衣壳蛋白和绿色荧光蛋白重组腺病毒的构建 为构建表达 O 型口蹄疫病毒 FMDV 的 P12A3C 基因及 GFP 基因的重组腺病毒 rAdV P12aEGFP2a3C 本研究以 FMDV 的 2A 基因序列为 Linker 将报告基因 EGFP 插入 FMDV 的 P12A 与 3C 之间 重组腺病毒感染 HEK 293 细胞后可以观察到绿色 荧光 表明 EGFP 蛋白获得表达 应用 FMDV 的 VP2 单克隆抗体 4B2 对重组病毒感 染细胞进行 western blot 检测 反应