RACE原理及应用

RACERACE 的简介的简介 目前 全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点 尽管已经 有多种方法可以获得基因的全长序列 但在很多生物研究中 由于所研究的目 的基因丰度较低 从而使得由低丰度 mRNA 通过转录获得全长 cDNA 很困难 近 年来发展成熟的 cDNA 末端快速扩增 RACE 技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径 cDNA 末端快速扩增 rapid amplification of cDNA ends RACE 技术是一 种基于 mRNA 反转录和 PCR 技术建立起来的 以部分的已知区域序列为起点 扩 增基因转录本的未知区域 从而获得 mRNA cDNA 完整序列的方法 简单的说就 是一种从低丰度转录本中快速增长 cDNA5 和 cDNA3 末端 进而获得获得全长 cDNA 简单而有效的方法 该方法具有快捷 方便 高效等优点 可同时获得多 个转录本 因此近年来 RACE 技术已逐渐取代了经典的 cDNA 文库筛选技术 成为 克隆全长 cDNA 序列的常用手段 第二第二 RACERACE 的原理的原理 RACE 是采用 PCR 技术由已知的部分 cDNA 顺序来扩增出完整 cDNA5 和 3 末端 是一种简便而有效的方法 又被称为锚定 PCR anchoredPCR 和单边 PCR one2side PCR 3 RACE3 RACE 的原理的原理 一 加入 oligo dT 17 和反转录酶对 mRNA 进行反转录得到 cDNA 二 以 oligo dT l7 和一个 35bp 的接头 dT17 adaptor 为引物 其中在引 物的接头中有一在基因组 DNA 中罕见的限制酶的酶切位点 这样就在未知 cDNA 末端接上了一段特殊的接头序列 再用一个基因特异性引物 3 amp 与少量第一 链 cDNA 退火并延伸 产生互补的第二链 cDNA 三 利用 3amp 和接头引物进行 PCR 循环即可扩增得到 cDNA 双链 扩增的特 异性取决于 3amp 的碱基只与目的 cDNA 分子互补 而用接头引物来取代 dT17 一 adaptor 则可阻止长 dT 碱基引起的错配 5 RACE5 RACE 的原理的原理 5 RACE 与 3 RACE 略有不同 首先 引物多设计了一个用于逆转录的基 因特异引物 GSP RT 其次 在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤 即先用 GSP RT 逆转录 mRNA 获得第一链 cDNA 后 用脱氧核糖核酸末端转移酶和 dATP 在 cDNA5 端加 poly A 尾 再用锚定引物合成第二链 cDNA 接下来与 3 RACE 过程相同 用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物 5amp 进行 PCR 扩增 全长全长 cDNAcDNA 的获得的获得 通过 RACE 方法获得的双链 cDNA 可用限制性内切酶酶切和 southem 印迹分 析并克隆 通常的克隆方法是同时使用一个切点位于接头序列上的限制性内切 酶和一个切点位于扩增区域内的内切酶 由于大多数非特异性扩增的 cDNA 产物 不能被后一个限制性内切酶酶切 因而也就不会被克隆 从而增加了克隆的选 择效率 还可以用在基因特异性引物的 5 端掺人一个限制性内切酶的酶切位 点的方法来克隆 最后 从两个有相互重叠序列的 3 和 5 RACE 产物中获得 全长 cDNA 或者通过分析 RACE 产物的 3 和 5 端序列 合成相应引物来扩增 mRNA 的反转录产物 从而获得全长 cDNA 第三第三 RACERACE 的应用的应用 RACE 技术主要是应用于对全长 cDNA 序列的获得 但对该技术进行一定的 修改后 也可在其它方面显示出极高的应用价值 首先 RACE 技术可用于 cDNA 文库的构建及筛选 Belyavaasky 等 1989 用 10 个骨髓瘤细胞分离的总 RNA 通过 TdT 加同聚尾 dT 16 引物反转录 接 着用 dC 13 和锚定引物扩增的方法建立了一个 106 克隆的 cDNA 文库 同时 用该方法构建文库的优点是它们都只需要很少量的实验材料 建喜等 2001 利 用 RACE 技术从已经构建的 cDNA 文库中成功克隆了家兔精子膜蛋白基因 其次 应用 RACE 克隆已知片段的旁侧内部序列 neighboring internal sequence Fritz 等 1991 以及 Struck 等 1994 分别用该法获得了 3 端和 5 端的旁侧序列 Zhang 1996 应用 LA PCR 方法获得了特异基因的 5 末端 非编码和编码序列 省去了构建及筛选基因组文库的麻烦 王东等 2003 利用 RT PCR 和 RACE 技术从玉米中获得一个长度为 2469bp F2KP 蛋白基因的 cDNA 克 隆 此外 RACE 技术还可用于克隆同源基因的同源片断 为寻找同基因提供了 一种方法 除此之外 Whitcomb 等设计的随机引物 锚定 PCR 能对克隆质粒载体上的靶 序列进行定点删除 采用 N 10 锚随机引物和变性的质粒 DNA 进行杂交 然后通 过 T7 聚合酶来延伸 这样单链 DNA 就可被一随机引物和一基因特异性引物扩增 一端可达到缺失删除 缺失的片段可达 2Kb Balavoine 应用连接介导 PCR 从一 种扁虫中克隆得到 8 个分别属于 Hox msh NK 1 和 NK 2 的含同源盒的片段 说 明 RACE 可用于克隆同源基因的同源片段 为寻找同源基因提供了一种手段 RACE 技术与生物信息学 例如 EST 库相结合 具有快速 高效克隆新基因的 特点 为快速钓取基因家族候选新成员提供新思路 如果一个基因是多基因家族 的一个成员 用基因特异引物 GSP 可能同时扩增几个高度同源的 Cdna 李红等 利用一条 cDNA 作为探针 通过 BLASTN 从 GenBank 中整合出了 7 条更长的 EST 通过设计引物 利用 RACE 扩增 得到了 7 条新基因 相比单纯寻找新基因的全长 此种方法的结合充分利用了信息巨大的基因资源库 得到了更多的信息 获得新 基因速度更快 效果更高 属一种颇具规模化的方法 很有应用前景 总之 随着 RACE 技术的不断改进和完善 优化 PCR 扩增的条件以提高扩增的 效率和忠实性 RACE 技术必将在基因克隆以及基因家族和基因表达变化等研究 中发挥极大的作用 第四第四 RACERACE 的优点与局限性的优点与局限性 RACE 技术相对于其他方法克隆全长 cDNA 来说具有价廉 简单和快速等特 点 用 RACE 获得 cDNA 克隆只需几天的时间 而且对丰度很低的起始反应物质 照样能迅速反馈是否有目的产物生成 因此 可根据不同的 RNA 制备来修订反 转录条件 以满足全长 cDNA 的获得 同时 通过 RACE 技术获得 5 端调控序 列和多聚腺苷化信号序列的信息 有助于选择引物以用于转录模型非常复杂的 基因中扩增 cDNA 的亚群 另外 RACE 技术能产生大量独立克隆 这些克隆可 用来证实核苷酸序列 并使得被选择性剪接或开始用于很少使用的启动子的特 殊转录物的分离成为可能 RACE 技术从理论上来说是很简单的 但是实际操作中会面临许多技术上的 难题 许多研究人员发现 利用 RACE 来获得全长基因并非如想像中那般成功 甚至经常会发生错误的扩增和克隆结果 多数情况下 5 端的编码区经常会由 于反转录过程的不彻底而丢掉 特别是由于有大的转录物或者存在复杂的二级结 构的时候 而且连接反应通常是特异性差效率很低 这样 PCR 成功进行就不能保 证 尤其在长片段扩增时 PCR 就显得不那么有效 例如几个 Kb 片段的产物就需 要优化改变扩增条件 而且扩增结果经常出现非特异性扩增条带 使得选择目的 条带变得十分困难 而对于丰度较低 长度较长的基因 RACE 方法困难更大 这是 困扰研究人员的一大难题 由于 RACE 扩增中经常出现由于引物的不匹配而导致 的非特异性扩增 有时需要进行几轮巢式扩增来达到获得特异性扩增的目的 然 而多轮扩增又容易提高 PCR 反应的错误发生率 由于这些原因 利用 RACE 技术通 常不易获得所希望的结果 尽管